[发明专利]一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法

权利要求书

1.一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、提取猪背最长肌中的总RNA，将其反转录成cDNA；

A2、引物的设计及PCR反应：根据已知的小鼠、大鼠和人的Sox6编码区序列，设计一对简并引物，上游引物自起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为：

上游引物（pSOX6CDS F）：5’-ATGTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTCC-3’

下游引物（pSOX6CDS R）：5’-TCAGTTGGCACTGACAG(C/G)(T/C)TC(T/C)GGG-3’

PCR反应体系为50μL[ddH₂O27μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2⁺ free）5μL，dNTP mixture（2.5mM each）8μL，MgCl₂（25mM）5μL，上下游引物（10μM）各2μL，cDNA（模板）0.5μL，TaKaRa LA Taq（5units/μL）0.5μL]；PCR反应条件均为95℃预变性3min，然后进行95℃30s，55℃30s，72℃3min，共35个循环，最后再72℃延伸10min；

A3、PCR产物的回收和纯化；

A4、克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A1包括以下步骤：用液氮将3日龄DLY仔猪背最长肌500mg磨成粉末装入1.5mL离心管，加入1mL TRIzol液，用手激烈摇晃混匀后，室温放置5min；4℃，12,000×g离心10min；将上清液用移液器转移到另一个新的1.5mL离心管，加入0.2mL氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇动15s后于室温下静置3min；4℃，12,000×g离心15min；取上层水相0.4mL至一新的1.5mL离心管，加入0.4mL冰预冷的异丙醇，轻缓充分混匀，室温静置10min；4℃，12,000g离心10min；弃上清，加入1mL75%乙醇（DEPC处理过的水配制）洗涤沉淀一次；4℃，7,500g离心5min；弃上清，晾干残余乙醇，加入20μL DEPC处理过的水溶解沉淀；取3μL于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余RNA样品于零下80℃贮存；

取1μg总RNA、1μL Oligo dT引物（50μM）和1μL dNTP mixture（10mM each），用DEPC处理过的水补充至10μL，65℃加热变性5min后快速置于冰中，再加入4μL5×PrimeScript Buffer、0.5μL RNase Inhibitor（40U/μL）、4.5μL DEPC处理过的水和1μL PrimeScript RTase（200U/μL），于42℃反应45min将其中的mRNA反转录为cDNA，最后于70℃作用15min以灭活反转录酶，立即使用或零下20℃保存备用。