[发明专利]叶酸修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及靶向药物，具体涉及一种叶酸修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法，以及该方法制备的药物在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

随着食品安全问题的出现，肿瘤发病率也在不断攀升，恶性肿瘤正成为威胁人类生命健康的杀手之一，然而肿瘤治疗却面临着困难和挑战，主要原因是放射性治疗和传统化学治疗缺乏选择性，在杀死肿瘤细胞的同时也会对正常组织和细胞产生一定毒副作用，许多癌症患者由于无法忍受这些毒副作用而选择放弃治疗，因此开发一种新型、高效率、低毒性并且对肿瘤组织具有一定靶向性的化疗药物事关重要。

众所周知叶酸受体（folate receptor，FR）是一种在多种肿瘤细胞高表达而在正常细胞低表达的糖蛋白。而叶酸是与叶酸受体有高度亲和力的小分子，此外具有高生物稳定性、较低免疫原性、且易与许多分子进行偶联，利用肿瘤细胞表面和正常细胞表面叶酸受体表达的差异性，制备新型的叶酸功能化纳米载药体系从而实现对肿瘤细胞的靶向性治疗已引起许多科研者的广泛关注。近年，随着纳米科技的发展，将纳米材料应用于载药方面的兴趣日益提高，如：碳纳米管，纳米硅，纳米金等，但均具有不同程度的毒副作用，因此纳米材料的安全性和生物兼容性始终是应用于临床上的制约因素。然而，令人可喜的是，纳米钻石是目前所有碳材料衍生物中具有最低毒性，高生物兼容性，且表面易修饰等优点，因此目前对纳米钻石的研究已得到广泛关注，例如：纳米钻石已显示能负载化疗药物等，与多种细作用和体内试验均显示纳米钻石的无毒性和生物兼容性。但目前据我们了解，尚未有靶向叶酸分子修饰纳米钻石负载药物的有关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有主动靶向特性的叶酸修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法，以及该方法制备的纳米钻石靶向药物在抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供的一种叶酸修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法，包括如下步骤：

（1）将羧基化的纳米钻石，在70-80℃真空干燥箱干燥过夜，按每毫克羧基化的纳米钻石加入1-1.5ml的MES（0.1M，pH5.8）缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化的纳米钻石中加入0.2mg EDC与0.28mg NHS，室温搅拌反应6h，以15000rpm离心5min，除去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；把活化羧基的纳米钻石沉淀物重新分散到硼酸缓冲溶液（BBS，0.1M，pH8.4）中，超声分散形成悬浊液，按每毫克活化羧基的纳米钻石加入0.5mg H₂N-PEG-NH₂，继续室温搅拌反应12h，待反应结束后，用硼酸缓冲溶液（BBS，0.1M，pH8.4）以15000rpm离心5min洗涤3次，再分别用1.5ml乙醇和1.5ml二甲基亚砜（DMSO）各离心洗涤2次，获得纳米钻石-聚乙二醇二胺（ND-PEG-NH₂）沉淀物；

（2）按每1mg ND-PEG-NH₂沉淀物溶于1ml DMSO中，超声分散10min，形成悬浊液，将活化的0.12mg叶酸（FA）逐滴加入ND-PEG-NH₂的悬浊液中，并向其中加入15μl三乙胺，在氮气保护下避光搅拌反应12h，得到沉淀物，分别用1.5ml乙醇和1.5ml DMSO以15000rpm离心5min洗涤2次，得到纳米钻石靶向载体ND-PEG-FA，放在真空干燥箱里避光保存；

（3）按每毫克干燥的ND-PEG-FA加入1mL浓度0.1M、pH8.0的硼酸缓冲溶液（BBS）中，避光超声分散10min形成悬浊液，接着按ND-PEG-FA与阿霉素（DOX）质量比100：7-10加入DOX，摇匀，避光反应6h；以15000rpm离心5min，用BBS洗涤3次，制得叶酸修饰的纳米钻石靶向药物ND-PEG-FA-DOX，真空干燥，冷藏，其粒径大小为232.4±5.2nm。

制备的ND-PEG-FA-DOX药物，经体外肿瘤细胞转运机制表明ND-PEG-FA-DOX具有能量依赖，是网格蛋白决定、叶酸受体介导机制进入细胞；用MTT法检测ND-PEG-FA-DOX对细胞活性的影响，表明该药物对癌细胞具有靶向抗肿瘤效应，并揭示ND-PEG-FA-DOX具有缓释药物特性。因此制备的靶向纳米药物ND-PEG-FA-DOX，既能降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，所以ND-PEG-FADOX可在制备抗肿瘤药物中应用。