[发明专利]可控量子点位点特异性桥接偶联的抗体标记方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及纳米生物技术领域，具体而言，涉及一种可控量子点位点特异性桥接偶联的抗体标记方法及其应用。

背景技术

量子点（Quantum dot，QD）又称半导体纳米晶，是一种纳米荧光材料，多呈球形，半径小于或接近激子波尔半径，直径一般在1～12nm。量子点作为荧光材料具有优异的荧光特性：拥有窄而对称的荧光发射光谱，发射波长随材料及粒径大小不同而不同，具有宽泛且连续的吸收光谱，斯托克斯位移较大，以上特性使量子点易于实现单波长激发多波长同时发射的多色标记功能。此外，相对于有机荧光染料，量子点具有很好的光稳定性，耐光漂白，荧光效率高等优点，且随着量子点表面配基化学修饰技术的发展，量子点生物相容性及标记效率的进一步提高，使得相关量子点生物标记物在科研、检测领域的应用得到了进一步拓展。

量子点探针标记要实现在生物领域的应用，首先要解决量子点与生物活性分子高效偶联的难题。其中可控、定向、定量是实现高效偶联的基本原则。传统的化学偶联方法，是利用生物分子表面的化学基团如蛋白表面的氨基或羧基等与量子点表面配基的活性基团交联。这种偶联方式缺乏位点特异性，导致偶联后生物分子活性下降、空间位阻、易聚沉等现象。取向性化学偶联方法，利用生物分子表面特定的化学基团如抗体的糖基等与量子点表面配基的活性基团交联。这种偶联方式尽管改善了位点特异性，获得了更高的偶联效率，但操作步骤仍较繁琐、条件难控制、易沉聚，不易重复，不能满足规模化生产的需要。此外使用化学偶联方法，往往需要量子点表面配基带有一定的活性基团如羧基或氨基等，这些基团通常容易与其它生物分子发生非特异结合而产生较高的背景信号，不利于高灵敏度检测。而利用分子生物学技术，在抗体亲和蛋白融合蛋白或合成的抗体结合肽基础上，加入利于交联的标签如半胱氨酸标签、组氨酸标签或生物素标签，获得抗体亲和配体，与表面含金属离子或亲和素修饰的量子点直接混合，即可实现蛋白与量子点高效、位点特异性自组装偶联。当利用金属配位偶联时，量子点表面可使用惰性配基修饰降低背景信号提高灵敏度。与采用分子生物学手段对每种目标蛋白分别进行遗传操作不同，此方法适用于通用型免疫活性量子点探针的快速标记。

发明内容

本发明旨在提供一种可控量子点位点特异性桥接偶联的抗体标记方法及其应用，以解决现有技术中抗体与量子点偶联缺乏位点特异性或操作步骤繁琐且不能满足规模化生产需要的技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供了一种可控量子点位点特异性桥接偶联的抗体标记方法。该方法包括以下步骤：在量子点表面上偶联抗体亲和配体；以及以抗体亲和配体作为桥接分子与抗体进行位点特异性自组装标记，其中，抗体亲和配体包括用于与抗体结合的抗体亲和蛋白或抗体结合肽序列、用于与量子点表面偶联的标签序列以及提供抗体亲和蛋白或抗体结合肽序列与标签序列之间空间间隔的间隔臂序列。

进一步地，抗体亲和蛋白序列为蛋白G、蛋白A、蛋白A/G或蛋白L；抗体结合肽序列为六肽HWRGWV。

进一步地，标签序列包括含有4～12个组氨酸的组氨酸标签、含有1～5个半胱氨酸的半胱氨酸标签或含有生物素修饰的标签。

进一步地，量子点表面带有供与标签序列连接的标签序列配体。

进一步地，配体包括配位金属离子或亲和素蛋白。

进一步地，抗体源自大鼠、小鼠、兔、羊、马、猪、牛或人。

进一步地，抗体包括通过免疫兔、羊、或鼠等动物产生的多抗、杂交瘤方法制备的单抗、异源表达的单抗或基因工程抗体。

进一步地，通过调节抗体的浓度控制抗体与抗体亲和蛋白或抗体结合肽的连接数量，并用酶解的抗体片段封闭未结合抗体的抗体亲和蛋白或抗体结合肽的结合位点。

进一步地，抗体亲和蛋白或抗体结合肽与量子点偶联摩尔比为1～200：1。

进一步地，抗体与量子点偶联摩尔比为0.5～100：1。

本发明还可提供一种可控量子点位点特异性桥接偶联的标记抗体在酶联免疫吸附、侧向免疫层析、细胞成像、流式细胞术、蛋白印迹中的应用。

应用本发明的技术方案，用带标签序列和间隔臂序列的抗体亲和蛋白或抗体结合肽作为桥接分子偶联量子点与抗体，连接方式简单、快速、可控且位点特异性好，偶联产物在大多数生物检测环境条件下稳定，且不必对所获得的抗体采取任何化学修饰或改造，只要其保守区与特定的抗体亲和蛋白或抗体结合肽有特异结合能力就可以进行自组装偶联，适用范围广，大大简化了量子点与不同抗体偶联的过程，利于系列抗体标记物的快速生产。

附图说明