[发明专利]用于核酸测序分析的标记的寡核苷酸探针

说明书

发明领域

本发明涉及通过使用荧光标记的寡核苷酸用于检测和分析核酸序列的方法。本发明具有用于基因分型、病原体检测和体外诊断的应用。

发明背景

核酸扩增技术的开发已改革了遗传分析和工程科学。例如，聚合酶链反应（PCR）通常使用所选择的引物核酸用于扩增特异性靶核酸，例如以促进靶核酸的检测作为诊断、法医取证或其他应用的一部分。引物通常成对发挥作用，其设计为朝向彼此延伸以覆盖所选择的靶区域。典型PCR循环包括在此期间双链核酸的链彼此分开的高温（例如85℃或更高）变性步骤，在此期间引物与分开的单链杂交的低温（例如45-65℃）退火步骤，和在此期间核酸聚合酶延伸引物的中间温度（例如约72℃）延伸步骤。还利用双温热循环操作。这些一般包括高温变性步骤和底物退火-延伸步骤。

检测扩增产物的多种策略已得到开发，并且最广泛使用的方法之一是5'核酸酶或TaqMan?测定。5'核酸酶测定通常利用某些DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性，以在PCR过程期间切割5'核酸酶寡核苷酸探针。该测定允许扩增靶和释放检测标记物两者，一般无需求助于扩增产物的多个处理步骤。5'核酸酶探针通常包括标记部分，例如荧光报道染料和猝灭染料。当探针完整时，报道染料与猝灭染料的接近一般导致报道荧光的抑制。在5'核酸酶反应期间，探针的切割使报道染料和猝灭染料彼此分开，导致来自报道物的可检测的荧光增加。PCR产物或扩增子的累积通常通过实时监控这种荧光增加间接地进行检测。

TaqMan?技术也可以用于单步测定中的DNA扩增和基因组检测。在该形式中，使用两种寡核苷酸探针，每个等位基因各一种，其设计为与含有等位基因特异性核苷酸的DNA模板区域杂交。探针各自用不同的荧光染料进行标记。在PCR扩增步骤期间，与模板完全匹配的探针被消化，导致来自相应染料的荧光信号增加。然而，具有单个核苷酸错配的探针不能对模板DNA稳定退火，并且无法通过核酸酶活性降解。来自“错配”探针的相应报道染料仍被猝灭剂分子猝灭，并且未显示出荧光信号。由于更复杂的荧光检测仪器的可用性，可以通过采用多重探针在这类测定中执行多重基因或一种基因的多重等位基因位置的基因分型，所述多重探针各自用每种独特的荧光报道染料进行标记。

发明概述

本发明涉及用于生成用于PCR反应中以检测靶核酸的标记的寡核苷酸探针的方法，所述标记的寡核苷酸探针含有荧光罗丹明衍生的染料。在第一个方面，本发明涉及制备用作PCR反应中的杂交探针的标记的寡核苷酸的方法，其包括：

提供罗丹明衍生物荧光染料，其中所述荧光染料附着有双功能接头分子；经由双功能接头分子使反应基团与荧光染料结合，用于将所述荧光染料掺入寡核苷酸内；

将荧光染料掺入寡核苷酸的两个内部核苷酸之间，前提是荧光染料不掺入寡核苷酸的5'末端处。

在第二个方面，本发明涉及用于检测测试样品中的靶核酸或核酸的靶等位基因的存在或不存在的方法，其包括：

使用与靶核酸杂交的标记的探针寡核苷酸执行PCR反应，其中标记的探针寡核苷酸的特征在于具有：罗丹明衍生物荧光染料，所述罗丹明衍生物附着有双功能接头分子；以及与双功能接头分子结合的反应基团，用于将荧光染料掺入寡核苷酸的两个内部核苷酸之间，前提是荧光染料不掺入寡核苷酸的5'末端处；检测来自荧光染料的信号，其中所述信号的强度代表靶核酸的存在或不存在。

附图简述

图1显示（A）罗丹明染料核心和（B）L-苏氨醇的化学结构。

图2显示JA270（羧酸类似物）的化学结构。

图3显示5染料参考试剂（5染料混合物，2 μM混合物）中的UPLC柱中的寡核苷酸洗脱模式，所述5染料参考试剂在同一天的上午（顶部）和夜间（顶部）运行。

图4显示使用荧光检测的5染料参考试剂的UPLC分析，所述5染料参考试剂含有内部标记的JA270寡核苷酸。

图5显示如通过UPLC分析的，“主混合物（mastermix）”溶液中存在的寡核苷酸。

图6显示如通过UPLC分析的，在4℃下贮存3天后的相同“主混合物”溶液中存在的寡核苷酸。

图7显示使用R33探针（图7 a）和R34探针（图7 b）生成的PCR生长曲线，所述R33探针和R34探针已与阳性对照质粒模板（RR）或阴性对照质粒模板（CC）一起贮存0天、3周或6周。

发明详述

定义