[发明专利]TAL介导的转移DNA插入

权利要求书

1.一种将所要多核苷酸稳定整合到植物基因组中的方法，其包含

(A)用包含编码TAL蛋白质的核苷酸序列的第一载体转化植物材料，所述核苷酸序列经设计以识别目标序列；

(B)用第二载体转化所述植物材料，所述第二载体包含(i)标记基因，其未可操作地连接于启动子(“无启动子的标记盒”)且其包含与所述目标序列同源的序列；以及(ii)所要多核苷酸；以及

(C)鉴别所述所要多核苷酸经稳定整合的经转化植物材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述经转化植物材料暴露于反映所述经转化植物中存在或不存在所述标记基因的条件。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标记基因为耐除草剂基因且所述经转化植物材料暴露于除草剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述耐除草剂基因为ALS基因。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述无启动子的标记盒稳定整合到所述植物基因组中。

6.一种将外源性DNA靶向插入到植物中的方法，其包含以下步骤：(i)用以下转化经分离的植物细胞

(A)包含启动子较少的盒的第一双运载体，所述载体包含(a)连接到(b)Ubi7内含子5'-未转译区的部分序列的右边界序列；(c)融合到突变乙酰乳酸合成酶ALS基因的Ubi7单体编码序列；(d)所要核苷酸序列；以及(e)终止序列，其中所述所要核苷酸序列未可操作地连接于启动子；以及

(B)第二双运载体，其包含(a)右边界；(b)正向表达盒和反向表达盒，其各自包含可操作地连接于强组成性启动子和终止序列的经修饰TAL效应子；以及(c)编码异戊烯基转移酶ipt的序列，其中所述经修饰TAL效应子经设计以结合马铃薯的泛素-7 Ubi7基因的内含子内的所述所要核苷酸序列；

以及(ii)在促进表达所述所要核苷酸序列的植物生长的条件下培养经分离的植物细胞；其中载体骨架DNA未永久地插入到所述植物基因组中。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述经修饰TAL效应子包含(a)包含Fok1核酸内切酶催化域的截短C端活化域；(b)密码子优化的目标序列结合域，其包含16.5个对应于所述Ubi7 5'-未转译内含子序列的重复可变双残基；以及(c)包含SV40核定位序列的N端区。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述所要核苷酸序列为靶向一或多种基因的沉默盒，所述基因选自由天冬酰胺合成酶1 Asn1、多酚氧化酶Ppo和液泡转化酶Inv基因组成的群组。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一双运载体另外包含晚疫病抗性基因Vnt1，所述基因可操作地连接于其原生启动子和终止序列。

10.一种经转化植物，其基因组中包含可操作地连接于所要外源性核苷酸序列的内源性Ubi7启动子，所述外源性核苷酸序列可操作地连接于外源性终止序列。

11.根据权利要求10所述的经转化植物，其中一或多种选自由天冬酰胺合成酶1 Asn1、多酚氧化酶Ppo和液泡转化酶Inv基因组成的群组的基因的表达下调。

12.根据权利要求11所述的经转化植物，其中所述植物另外表达晚疫病抗性基因Vnt1。

13.根据权利要求12所述的经转化植物，其中所述植物为具有块茎的植物。

14.根据权利要求13所述的经转化植物，其中所述具有块茎的植物为马铃薯植物。

15.根据权利要求14所述的经转化植物，其中所述植物具有由以下中的一或多者表征的表型：晚疫病抗性、黑斑碰伤耐受性、降低的低温诱发甜化和其块茎中降低的天冬酰胺含量。

16.一种根据权利要求15所述的经转化植物的热加工产品。

17.根据权利要求16所述的热加工产品，其中所述产品为法式炸薯条、薯片、脆片、马铃薯、脱水马铃薯或烤马铃薯。

18.根据权利要求17所述的热加工产品，其中所述热加工产品的丙烯酰胺含量低于相同物种的非转化植物的热加工产品。