[发明专利]针对活化蛋白C (aPC)的单克隆抗体

说明书

本申请要求2012年11月29日提交的美国临时专利申请号61/731,294和2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/786,472的优先权，它们的公开内容因此以其整体作为参考并入本文。

序列表提交

与本申请相关的序列表以电子形式通过EFS-Web提交，并因此以其整体作为参考并入说明书。

实施方式领域

提供了分离的单克隆抗体和其片段，其优先结合人蛋白C的活化形式(aPC)。

背景

人蛋白 C (PC)酶原在肝中作为461个氨基酸残基前体合成并分泌到血液中(如SEQ ID NO: 1中所示)。在分泌之前，单链多肽前体通过除去二肽 (Lys156-Arg157)和 42个氨基酸残基前原前导序列（preproleader）转化成异二聚体。异二聚体形式(417个残基)由通过二硫桥连接的轻链 (155aa, 21 kDa)和重链 (262aa, 41 kDa)组成(如SEQ ID NO: 2中所示)。PC 酶原包含凝血酶切割位点，导致“活化肽”的去除和PC活化成活化的PC(aPC)形式(405个残基) ，其显示于SEQ ID NO: 3中。图 1 提供人PC及其活化形式aPC的卡通描绘。人 PC 包含 9个 Gla-残基和4个用于N-联糖基化的潜在的位点。轻链包含Gla 结构域和2个 EGF-样结构域。重链带有活性丝氨酸蛋白酶结构域。

PC通常以3-5ug/ml(~65nM)在健康人血液中循环且其半衰期为6-8小时。循环型PC酶原的主要形式是异二聚体形式。PC的轻链含有一个富含γ-羧基谷氨酸(Gla)的结构域 (45aa) 、两个EGF样结构域(46aa)和接头序列。PC的重链带有12-aa的高度极性“活化肽”以及具有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体的催化结构域。

人 PC经历广泛的翻译后修饰，包括糖基化，维生素K依赖性γ-羧基化和γ-羟基化(1-2)。它含有23％的碳水化合物（以重量计）和4个潜在的N-联糖基化位点（一个在轻链Asn97和三个在重链Asn248/313/329)。 其Gla结构域含有9个Gla残基并负责PC钙依赖性结合至带负电磷脂膜。Gla 结构域也可结合内皮蛋白 C受体 (EPCR) ，其在PC活化期间与内皮膜上的凝血酶以及凝血调节蛋白密切合作。

蛋白 C 酶原通常转化为它的活性酶-活化蛋白C(aPC)以具有生物效力。PC途径的活性是由PC活化以及aPC失活的比率所控制。PC活化以两步骤过程发生在内皮细胞表面上。其需要PC结合(经由Gla结构域)至内皮细胞上的EPCR，然后是PC通过凝血酶/凝血调节蛋白复合物的蛋白水解活化。由内皮细胞表面上的凝血酶/凝血调节蛋白催化的在人PC重链Arg12处的单一切割释放12-aa的AP并且将酶原PC转化成活性丝氨酸蛋白酶aPC。因此，PC和的aPC的氨基酸序列之间的主要区别是PC中存在12-aa活化肽，而在APC中不存在。PC活化成aPC也诱导构象变化；因此只有aPC而不是PC可在其酶活性位点中被苯甲脒或以氯甲基酮(CMK)肽抑制剂标记。近来已解析无Gla-结构域aPC在与CMK-抑制剂的复合物中的晶体结构。人血浆中的主要aPC灭活剂为以100nM存在于人血浆中的蛋白C抑制剂(PCI)，其为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族的成员。在生理条件下，aPC以极低浓度(1-2ng/ml或40pM)循环于人血液中，半衰期为20-30min。

蛋白C途径充当对抗血栓的天然防御机制。其不同于其它抗凝剂，因为它是一种按需系统(on-demand system)，当凝血反应增强时其能够放大抗凝反应。在受伤之后，产生凝血酶用于凝血。同时，凝血酶也通过结合至排列在血管表面上的凝血调节蛋白而触发抗凝反应，这促使蛋白C活化。因此，aPC生成大体上与凝血酶浓度以及PC水平成比例。

蛋白C途径作为凝血过程的主要调解者的生理学重要性通过三个临床发现显示：(a)与蛋白C缺乏相关的严重血栓并发症以及通过蛋白C补充纠正该缺陷的能力；(b)与蛋白C辅因子(蛋白S)缺乏相关的家族性血栓形成倾向；以及(c)与在其底物(因子V Leidei R506Q)中的遗传性突变有关的血栓风险，使其对于被aPC切割具有抗性(Bernard,GR et.al.N Engl J Med 2001,344：699-709 综述)。