[发明专利]评价内体运输的测定

说明书

本发明涉及用于评价分子递送到真核细胞内的效率的测定和相应试剂盒。

任何潜在治疗分子发挥功效的关键要求是其必须能够表现出良好的效能。本发明涉及经由熟知的内吞过程进入真核细胞胞质的分子。鉴于此，重要的是理解该细胞进入模式所涉及的步骤。因而，为了帮助例示与该细胞进入模式相关的关键步骤，可参考图1。在步骤1中，分子与细胞表面上存在的结合位点(例如受体或接受体)结合。在步骤2中，受体(加上结合的分子)变成内化到细胞中-该步骤通称为“内吞”或“内体形成”。在步骤3中，在内化之后，分子插入内体膜，并实现所述分子(或其一部分)从内体内、穿过内体膜和进入真核细胞胞质的释放。一旦在胞质中(步骤4)，所述分子能够作用于其胞内靶(例如抑制靶分子，如蛋白水解切割细胞靶蛋白)。

因此良好效能测试有赖于准确评价一个或多个上述步骤。

迄今为止，对能够经由“受体介导的内吞”进入真核细胞的分子的效能测试集中在毒性分子如梭菌神经毒素。举例而言，以下测定已被用于市售的梭菌神经毒素(例如肉毒杆菌神经毒素，其市售名诸如Dysport^TM,Neurobloc^TM和Botox^TM)。

小鼠LD₅₀测定是目前唯一经FDA批准用于发布肉毒杆菌毒素的测定。该测定同时测试肉毒杆菌神经毒素的所有三个结构域的作用(即结合、易位和蛋白酶)。更具体而言，其限定该毒素在限定时间点(通常在给药后2-4天)的半数致死腹膜内剂量(活性以小鼠LD₅₀单位表示)。然而令人遗憾的是，LD₅₀测定使用大量动物。而且，LD₅₀单位不是绝对测量值，因为其不是生物学常数-由此其高度取决于测定条件。特别是，伴随该测定的误差在不同测试设施间可以高至60％(Sesardic et al.2003；Biologicals 31(4):265-276)。

小鼠弛缓性麻痹测定，也称为“小鼠腹下垂测定”，将肉毒杆菌毒素的活性与将毒素皮下注射到小鼠左腹股沟下肢区域后看到的腹部凸出程度相关联-麻痹大小程度是剂量依赖性的。该方法被提出作为小鼠LD₅₀测试的改进，因为其建立在人道的终点上。该测定比LD₅₀测定更敏感约10倍，使用亚致死剂量的毒素，且比LD₅₀测试更迅速-其在24-48小时提供结果，相比于典型LD₅₀测定的72-96小时。来自该测定的结果显示出与LD₅₀值优异的一致性(Sesardic et al.,1996)。尽管该测定使用LD₅₀测定中所用动物的20％，其仍然必需使用动物。

诸如小鼠/大鼠膈神经半膈测定(其基于使用离体神经肌肉制备物)的测定将肉毒杆菌神经毒素的活性与将其应用于维持培养基后所述制备物抽动反应幅度的下降相关联。该测定的通常终点是观察到幅度下降50％前所需的时间。但是遗憾的是，半膈测定(象LD₅₀测定)导致使用大量动物。此外，该测定需要培训过使用复杂且昂贵设备的高技能人员。

使用培养脊髓神经元的底物切割测定将肉毒杆菌神经毒素的活性与对所述神经元中存在的特异性蛋白质的切割相关联。尽管该测定比体内(LD₅₀，小鼠弛缓性麻痹)和离体测定(半膈)使用较少的动物，所述测定需要高技能人员来进行解剖和培养-解剖和培养技术是耗时的且必须在需要进行前～3周计划。另一个缺陷是底物切割测量值可以是高度可变的。

所有上述测定都具有特定的缺点，尤其是动物福祉问题和/或限制于测试与神经肌肉接头(NMJ)结合的分子-后者是天然梭菌神经毒素结合的靶细胞。

WO95/33850描述了一种无细胞底物切割测定，其中通过表位特异性抗体来检测切割产物。由于所述抗体能够区分经切割的底物和未切割底物蛋白，有可能定量梭菌神经毒素的效能。尽管该测定没有上述动物福祉或NMJ特异性不足，其实际上是“无细胞”测定且由此仅仅能够评价在蛋白质切割方面的效力。相应地，WO95/33850不能评价在任何一个或多个同等重要的步骤方面的效能，尤其是：细胞结合；内体形成；或穿过内体膜易位。换言之，(根据WO95/33850)鉴别为有效的底物切割分子的分子可能具有极少或没有有用的治疗效能-例如由于其缺乏以下任何一种或多种：最佳的细胞结合；最佳的内体形成；和/或最佳的易位功能。