[发明专利]用于核酸测序的方法和试剂盒

说明书

相关申请

本发明要求于2012年8月6日提交的美国临时申请系列号61/680,212 的优先权，其通过引用完全结合在本文中。

发明领域

本发明涉及用于测序单一核酸(基因组DNA，RNA，cDNA等)分子和其他分子的分子生物学方法和传感器设计、制造和应用，例如，以允许高度平行的、高通量的单一分子和长读取长度的DNA测序和片段长度分析。

发明背景

DNA(脱氧核糖核酸)通常是由称为核苷酸的亚基组成的长的聚合物。这些单个亚基的链形成称为核酸的分子，其中DNA和RNA(核糖核酸)是目前自然中最常见的实例。天然的脱氧核糖核酸由沿着核糖/磷酸骨架的四个碱基(腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)) 中的一种构成。在天然存在的核糖核苷酸群体中，胸苷被替换为尿嘧啶 (U)。当通过在核糖骨架的5’和3’位置形成磷酸二酯键聚合时，核酸可以携带细胞中的遗传信息。核酸中的碱基能够与另一个碱基形成氢键，促使稳定的双链分子的形成，在DNA的情形中，其每一半是另一半的反向互补物。DNA包含两个含有四种不同核苷酸碱基的长的核苷酸链(例如， AGTCATCGT...等)，具有的糖和磷酸基团的骨架通过酯键连接，扭曲成双螺旋并且通过互补核苷酸之间的氢键连接(A通过氢键结合相反的链中的T，C和相反链中的G氢键结合)。沿着骨架的核苷酸碱基的序列可以携带丰富量的信息，并且可以包含巨大部分的遗传信息，如个体遗传特征。

分子生物学的中心法则通常是如下述描述生物学信息的正常流转： DNA可以复制成DNA，DNA中的遗传信息可以‘转录’成RNA，如信使RNA(“mRNA”)，并且可以由mRNA中的信息翻译成蛋白。在翻译过程中，使得蛋白亚基(氨基酸)以mRNA的序列并且最终以其所转录的DNA所示的顺序足够接近以键合。这一过程涉及称为tRNA(“转运 RNA”)的氨基酸适体RNA的碱基配对，在核糖体的存在，每个tRNA携带由其针对mRNA序列的序列决定的特定的氨基酸，核糖体本身是在 rRNA(“核糖体RNA”)周围构建的蛋白复合物。通过这一过程，遗传 DNA序列利用mRNA中间物和tRNA与rRNA组分指定了要组装成多肽的氨基酸的序列。

术语核酸测序通常包括用于确定DNA或RNA分子中的核苷酸碱基 (即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的顺序的生物化学方法。 DNA的序列组成细胞核、线粒体和叶绿体中的遗传性遗传信息，其形成活生物体的发育程序的基础。遗传变异可能引起疾病，赋予增加的疾病的危险或赋予有益的特性。这些变异可能是遗传的(传承自父母)或获得性的(成年时发育，如通过DNA复制中的错误发展)。因此，知晓这些遗传分子的序列对于获得对生命、分子系统和疾病的更好的理解是特别重要的。

DNA分析最初被广泛誉为DNA谱分析(DNA指纹)，并且在1987 年成为商业可用的，那时化学公司Imperial Chemical Industries(ICI)在英格兰开设了血液检测中心。该技术最先由英格兰莱斯特大学的Sir Alec Jeffreys报道，现在成为数个国立DNA数据库的基础，包括美国的CODIS 组。该技术利用称为变数串联重复序列(variable number tandem repeats， VNTRs)的高度可变的重复(“重复”)序列，特别是短的串联重复(short tandem repeats，STRs)。VNTR基因座在血缘密切的人之间是非常相似的，但是如此可变，以致没有血缘关系的个体极不可能具有相同的VNTRs。扩增和随后的扩增子的片段长度分析提供了关于个体的身份或血缘关系的有力的遗传信息。

DNA测序的出现已经显著加快了生物学研究和发现，并且将DNA 测试的应用从简单的概图扩展到疾病诊断，甚至是疾病预测。利用现代 DNA测序技术可获得的快速的测序速度已经成为人类基因组计划中的大规模测序人类基因组的手段。相关计划已经产生了多种动物、植物、病毒和微生物基因组的完整的DNA序列。

RNA测序从技术原因上来讲比DNA测序容易操作，其是最早的核苷酸测序形式之一。溯及重组DNA之前的时代，RNA测序的主要里程碑是第一个完整的基因的序列，然后是噬菌体MS2的完整的基因组，其由根特大学(比利时根特)的Walter Fiers与其同事在1972-1976年鉴定并且公布。