[发明专利]特异结合性或功能性蛋白的转座介导鉴定

说明书

在此公开的方法描述了一种前所未有地高效、灵活、实用和高速的用于探索和优化具有期望的结合特异性和/或功能性的多肽(包括抗原结合分子，例如抗体及其片段)以获得期望的功能性和/或结合性表型的新型科技。该新方法基于：转座结构和克隆入转座载体的多样化DNA文库，及其通过功能性转座酶的共同瞬态表达对宿主细胞进行转染。这保证了高效稳定地将基于转座子的表达载体一步引入脊椎动物宿主细胞，随后筛选所述细胞中表达的蛋白的期望功能性或结合性表型，然后可以通过标准的克隆和DNA测序技术，鉴定所述表达蛋白的相关编码序列，包括抗体及其片段。

背景技术

技术领域

(a)用于鉴定特定功能性和结合性蛋白的技术

目标特异性蛋白的发现，包括抗体及其片段，带来了巨大的商业利益，这是因为选择高选择性功能蛋白或结合蛋白，包括抗体及其片段，有极高潜力可用于开发具有新治疗性质的新生物实体(NBEs)，所述生物实体可以极高特异性融入或干涉生物过程，从而据预测比传统新化学实体(NCEs)的副作用要低。基于此，尤其是对高目标特异性的治疗性抗体和基于抗体的治疗剂的发展，为效力提高的全新疗法铺平了道路。由此一来，在过去的十年中，治疗性单克隆抗体成为了新药开发中增长速度最快的部分，且目前产生的全球总收入为约500亿美元，是全球药物制品市场中的重要组成部分。

因此，迫切需要能够发现药效强且又耐受良好的治疗性蛋白、尤其是基于抗体的药物的新型高效技术。

为了识别具有期望功能性特异结合性质的蛋白，例如对于抗体而言，需要生成、功能性表达并筛选大型多样化蛋白质集合或文库，包括抗体及其片段，以获得期望的功能性质或靶向结合特异性。过去的20年间，发展出了许多技术，用于在宿主细胞或病毒和噬菌体颗粒中表达多样化蛋白文库，以及用于该文库的高通量筛选和/或淘选以获得期望功能性质或结合表型的方法。

用于识别目标特异性结合剂或具有期望功能性质的蛋白的最新标准技术包括，例如噬菌体展示、反转录病毒展示、酵母菌展示和各种哺乳动物细胞展示技术，并结合固体表面结合(淘选)和/或其他富集技术。所有这些技术都包含在各种专利和审查中的专利申请中。

虽然噬菌体和原核展示系统已经建立并广泛运用于生物技术产业和学术界中，用于鉴定目标特异性结合剂，包括抗体片段(Hoogenboom，Nature Biotechnology 23，1105-1116(2005))，但其具有多种缺陷，包括无法表达较大蛋白的全长(包括全长抗体)、缺乏适当的转录后修饰、缺乏脊椎动物分子伴侣的适当折叠，以及，对于抗体而言，人为进行的重链和轻链组合。因此，对于所述方法的抗体探索而言，要求″重组″为全长抗体并进行哺乳类细胞表达。由于上述缺陷的存在，这往往造成抗体中的不良生物物理性质(例如，低稳定性、聚集倾向、亲和性弱化)，限制了所述蛋白在医疗和诊断上的应用潜力。一方面，这导致所述方法开发生成的先导分子具有显著的损耗率，另一方面，要求耗费大量精力来修正蛋白的生物物理和分子性质，才能用于进一步的下游药物开发。

因此，已经使用低等真核细胞(例如酵母菌)开发蛋白质和抗体探索技术，且最近还使用了哺乳动物细胞表达体系来鉴定具有期望性质的蛋白，因为这些技术允许(i)表达较大的全长蛋白，包括全长抗体；(ii)更好或正常地进行翻译后修饰；以及(iii)对于抗体而言，进行适当的轻链-重链配对(BeerliRader，mAbs 2，365-378(2010))。综合来说，这用于选择在药物开发和治疗用途中潜力更高的具有优秀生物物理性质的蛋白质。

蛋白在脊椎动物细胞中的表达和筛选是最期望实现的，这是因为脊椎动物细胞(例如仓鼠CHO、人HEK-293或鸡DT40细胞)是生产较大医疗蛋白(例如抗体)的优选表达体系，但虽然如此，所述技术目前具有许多缺陷，使其在学术和工业应用中进展缓慢。