[发明专利]高产量地分离包括小RNA的RNA的方法

说明书

本发明提供了从样品分离RNA，包括尺寸为200nt或更少的小RNA的方法，包括以下步骤：a)提供包含RNA和离液剂的组合物；b)加入醇；c)温育该混合物至少2分钟；d)将额外的醇加入该混合物以将混合物中的总醇浓度调节至≥50％；e)将该混合物中所含的RNA结合至核酸结合固相；f)任选地洗涤该结合的RNA；g)任选从地固相洗脱RNA。由于分步加入醇，总RNA产量和小RNA的产量得到提高。

本发明涉及从样品中分离RNA，包括小RNA的方法，特别是提供高产量地从各种样品中有效分离总RNA，包括小RNA的手段。

研究各种组织、体液和其它生物学样品中约500个核苷酸或更小量级的小核酸是极其感兴趣的领域，并有望保持于将来。小核酸尤其包括但不限于：小RNA，例如微小RNA(miRNA)和小干扰RNA分子，二者都可以对基因表达产生强有力的影响。此外，参与mRNA和rRNA加工的其它小核与小核仁RNA(如snRNA和snoRNA)也令人感兴趣。此外，长度为500个核苷酸或更小的核酸，如RNA也常常作为降解产物包含在其它样品中，必须有效地从中捕捉。随着对各小RNA的兴趣日益增加，标准分离程序得到改进以促进小核酸的分离，特别是提高小核酸的产量。用作分离总RNA标准的这种已知方案对于分离小RNA通常不理想，因为小RNA往往不能在分离期间采用标准方法被有效地捕获和洗脱。因此，采用标准程序分离的总RNA通常不包含足够量的小RNA，因而无法提供可接受的产量，因为在核酸分离过程小RNA或未结合或丢失。因此，需要改进的技术来有效分离总RNA，包括所需的小RNA。

为分离小RNA而作优化的方法往往依赖于酚/氯仿抽提和随后的醇分馏。基于酚/氯仿的有机提取方法常按照Chomczynski方法实施(Chomczynski和Sacchi,1987:通过酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取的RNA分离单步法(Single-step method of RNA isolation byacid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction).Anal.Biochem.(162):156-159)。根据所述方法，RNA在苯酚/氯仿萃取期间浓缩于水相，然后从中分离，例如通过加入醇并将RNA结合到核酸结合固相。在所述结合步骤中，再次需要特定的条件以有效捕获分离的总RNA中的小RNA。基于相应的苯酚/氯仿法的商业试剂盒是MirVana miRNA分离试剂盒(安比昂公司-Ambion)。苯酚/氯仿萃取后，该方案遵循分馏策略，其中较大的RNA(超过200个核苷酸)在中等醇浓度(通常30-40％)下，在第一结合步骤中结合于核酸结合固相。流出物(flow-through)包含小RNA。通过第二结合步骤，将醇浓度提高到50％以上(通常为55-70％)并使小RNA结合到第二固相以便自流出物中捕获所述小RNA。该方案不方便，因为需要两种不同的结合条件和两种不同的核酸结合固相。此外，MirVana miRNA分离试剂盒提供一方案，其中包括小RNA的总RNA是从苯酚/氯仿萃取后获得的水相中分离。在此，结合条件是通过在一步中增加醇浓度到所需量(通常为55-70％)而产生的。WO 2005/012523和WO 2005/054466也描述了相应的方法。然而，在这些方案中，也要预先实施有机苯酚/氯仿萃取步骤。另一基于苯酚/氯仿的商业产品是miRNAeasy Mini试剂盒(凯杰公司-QIAGEN)。它提供了来自各种不同生物学样品的高品质和高产量的总RNA，包括小RNA。

然而，需要有机提取步骤(例如特别是苯酚/氯仿提取)的此类方法有缺点，因为苯酚是有毒的试剂。本领域急需无苯酚的RNA分离方法，以便高产量和高质量地从各种样品分离包含小RNA的总RNA。