[发明专利]用于针对金黄色葡萄球菌的免疫的稳定化的蛋白质

说明书

本申请要求2012年8月31日提交的美国临时申请61/695,782的权益，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及包含衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原的免疫原性组合物及其在免疫中的用途。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性球菌，并且是血流、下呼吸道和皮肤以及其他软组织感染的主要原因。其导致从轻度皮肤感染到致命性疾病(包括肺炎和败血症)的多种疾病，且在美国每年与金黄色葡萄球菌相关的死亡率超过了任何其他感染性疾病(包括HIV/AIDS)。

目前没有批准的针对金黄色葡萄球菌的疫苗。在2005年的III期临床试验中，与安慰剂组相比，基于来自5型和8型细菌的表面多糖混合物的疫苗StaphVAX^TM无法减少感染。参考文献1报道了来自默克公司(Merck)和因特塞尔公司(Intercell)关于“V710”疫苗的数据，该疫苗基于单个抗原IsdB，这是一种保守的螯合铁的细胞表面蛋白[2，3]。然而，V710的临床试验在2011年终止，其依据是观察到V710不太可能表现出统计学上显著的临床益处，且与安慰剂接受者相比，在疫苗接受者中出现了更高频率的涉及总体死亡率和多器官功能障碍的安全问题[4]。

参考文献5公开了各种金黄色葡萄球菌抗原及其组合，包括用作疫苗策略的“Combo-1”(EsxA、EsxB、突变型Hla、Sta006和Sta011的混合物)和“Combo-2”(EsxA、EsxB、IsdA、Sta006和Sta011的混合物)。参考文献6公开了金黄色葡萄球菌多肽抗原在简单的缓冲溶液中可能不稳定并可通过加入稳定化添加剂(如EDTA)来稳定该抗原。抗原的不稳定是不希望的，因为(1)这使得疫苗不能在给药之前长时间储存，和(2)疫苗批次之间的不一致会影响品质和监管审批的要求。此外，含有这些不稳定抗原的疫苗的生产会变得复杂且涉及多个纯化步骤。因此，本发明的一个目标是鉴定使免疫原性组合物中的金黄色葡萄球菌多肽抗原稳定的其他策略。

发明内容

发明人发现，避免抗原的寡聚化是提高抗原稳定性的有效策略。多种金黄色葡萄球菌抗原含有半胱氨酸残基，且它们可在标准缓冲溶液中形成寡聚体，包括由半胱氨酸残基之间的二硫键形成的共价二聚体。发明人发现，含有这些共价二聚体的组合物可能是不稳定的，并且可形成聚集体或影响组合物中其他抗原(如果存在)的稳定性。可通过取代、修饰或去除半胱氨酸残基从而使二硫键无法形成的方式防止共价二聚体的形成。有趣的是，防止这些抗原形成共价二聚体提高了抗原稳定性并维持了组合物的高度总体选择性(即相对于总体抗原存在高比例的单一同种型)和纯度。此外，发明人发现，这些半胱氨酸缺陷型抗原在引发针对野生型含半胱氨酸抗原的免疫应答上仍然有效。因此，可在免疫组合物中包含半胱氨酸缺陷型抗原以提高抗原稳定性。

Sta006和Sta011抗原的成熟形式中天然具有N-末端半胱氨酸。EsxB蛋白天然含有内部半胱氨酸残基。发明人发现野生型含半胱氨酸的Sta006、Sta011、Hla和EsxAB的组合在水性条件下没有良好的长期稳定性。野生型含半胱氨酸的EsxAB、Sta006和Sta011可在缓冲溶液中发生氧化还原反应并且形成不稳定的同二聚体或异二聚体(例如，Sta006/Sta011等)。这些二聚体可因半胱氨酸残基之间形成二硫键而产生。发明人发现二硫键形成的消除(例如，通过取代、修饰或删除半胱氨酸残基)使抗原之间以及抗原与其他组分之间的干扰最小化。因此，包含在还原条件下不含任何游离巯基的EsxAB、Sta006和Sta011的变体(因而不形成同二聚体或异二聚体)的免疫原性组合物比含有含半胱氨酸残基(即在还原条件下含游离巯基)的野生型抗原更稳定。发明人发现含有不含巯基的抗原变体的免疫原性组合物能在液体制剂中稳定至少4周。这种免疫原性组合物也显示具有更高的选择性、再现性、稳定性、纯度和改善的加工特点。因此，可以较少的纯化步骤生产本发明的免疫原性组合物。因此，生产过程更为简单和高效。