[发明专利]用于检测细胞样品中的活细胞的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年5月2日提交的共同未决的美国临时专利申请号61/641,809和2013年3月14日提交的共同未决的美国临时专利申请号61/784,789的优先权和权益，将各申请的全部内容通过引用结合在此。

发明领域

本发明大体上涉及一种用于确定液体样品中的活细胞的存在和/或量的系统和方法。

背景

例如由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、以及真菌(例如酵母菌和霉菌)造成的微生物污染可以导致严重的疾病，并且在一些情况下甚至导致人类和动物受试者中的死亡。在某些产业例如食品、水、化妆品、制药、以及医疗器械产业中的生产商必须符合严格的标准验证他们的产品不包含一定水平的微生物污染物，否则会损害消费者或接受者的健康。这些产业需要针对微生物污染物的存在进行频繁的、准确的、灵敏的测试，以符合某些标准，例如由美国食品与药品管理局或环境保护局规定的标准。

取决于情况，区分活细胞与非活细胞的能力还可以是重要的。例如，在药物制剂和生物制剂的生产期间，重要的是在生产过程中使用的水是无菌的并且不含污染物。并且，重要的是在药物(例如，液体药物制剂和生物剂型，例如可注射的剂型)中包含的水以及例如经由非肠胃外途径给予至受试者的液体(例如，盐水)也是无菌的并且不含污染物。在另一方面，在饮用水中一些活微生物的存在可以被接受为直到达到一个点。为了适于饮用，饮用水必须符合严格标准。即使微生物可以存在于供水中，该水可依然对于人类消费来说是可接受的。然而，一旦细胞数超过一个阈值水平，该水可能不再被视为对人类消费是安全的。并且，在某些食物产品(例如，生鲜产品)和饮品(例如，牛奶)中某些预定水平的微生物的存在可以是可接受的。然而，一旦已经超过那些水平，食物或饮品可被视为已经变质并且对于人类消费不再安全。

用于评估微生物污染的存在和/或微生物污染的程度的传统的细胞培养方法可以耗费几天来进行，这取决于测试针对的微生物。在此期间，存在怀疑的产品(例如，食物、饮品、或医疗产品)可以被检疫隔离，直至结果获得并且产品可以释放。因此，存在一种快速检测(例如，在数小时之内或更短)样品中的微生物污染物特别是活的微生物污染物的存在和/或量的系统和方法的需求。

概述

本发明部分地是基于检测液体样品中的活细胞(例如，原核细胞或真核细胞)的存在和/或数量的方法的发现。该方法可以与一种细胞捕获系统和/或光学检测系统组合使用以检测细胞样品中活细胞的存在。该方法可以用于一种用以测量感兴趣的特定样品的生物负载(例如，用以测量活细胞(例如，活的微生物，如细菌、酵母菌、以及真菌)的数目和/或百分比和/或分数)的方法中。

在一方面，本发明提供了一种检测液体样品中的活细胞的存在和/或数量的方法。该方法包括：(a)在将有待测试的该液体样品通过一种基本上平面的多孔膜之后，对由该基本上平面的多孔膜的至少一部分保留的任何活细胞用一种荧光标记物进行标记；(b)通过相对于一个检测系统旋转该多孔膜对该多孔膜的该部分进行扫描，该检测系统包括(i)一个光源，该光源发射一束具有一个波长的光，该波长被适配为激发该荧光标记物产生一个发射事件，以及(ii)至少一个检测器，该至少一个检测器能够检测该发射事件，由此查询该平面多孔膜的多个区域，并且检测通过与任何活细胞相关联的荧光标记物的激发而产生的发射事件；并且(c)通过基于步骤(b)中检测的发射事件确定由该膜捕获的活细胞的存在和/或数量。

该扫描步骤可以包括用该束光示踪该多孔膜上的嵌套圆形图案和螺旋图案中的至少一个。应理解的是在该扫描步骤期间，该多孔膜可以移动(例如，经由直线平移和/或围绕一个旋转轴旋转)，同时该检测系统保持静止。可替代地，该检测系统可以移动(例如，经由直线平移)，同时该多孔膜围绕单个点旋转(例如该多孔膜围绕旋转轴在单个位置处旋转)。可替代地，可能的是多孔膜和检测两者可以移动并且它们的相对位置可以相对于彼此来测量。

在某些实施例中，在步骤(a)中，将这些细胞使用下文更详细描述的活细胞染色剂和/或活细胞染色系统进行标记。

检测方法可以在单一的细胞、细胞簇或细胞集落上进行。在某些情况下，例如，为了增加测定的灵敏度，可以希望的是在将细胞暴露于荧光染料和荧光淬灭剂之前和/或期间和/或之后，在允许细胞增殖的条件下培养细胞。包括生长培养基、温度、培养持续时间的选择的培养条件可以被选择为允许样品中的至少一种细胞具有一次或多次细胞分裂。