[发明专利]缀合试剂

说明书

本发明涉及用于将聚合物缀合到蛋白质和肽的新型缀合试剂，还涉及生产新型缀合物的新方法。

许多治疗活性分子，例如蛋白质，不具有在临床医学用途中达到效果所需要的性质。例如，许多天然蛋白质不能作为良好的药物，因为在将其给予患者时有几个固有缺点，包括：(1)蛋白质被多种存在于血液或组织中的肽链内切酶和肽链端解酶消化；(2)在一定程度上，几乎所有的蛋白质都是免疫原性的；和(3)蛋白质能被肾脏超滤作用和细胞内吞作用快速地排泄。一些被发现可在医学上作为活性治疗剂的分子具有全身毒性或缺乏最佳生物利用度和药物动力学。如果蛋白质很快地从血液循环清除，则它们通常不得不被频繁地给予患者。频繁的给药进一步提高毒性风险，尤其是免疫学衍生的毒性。通常很难达到治疗有效剂量，因此效力受损。因此，快速清除既是效力问题也是安全性问题。

水溶性合成聚合物，特别是聚亚烷基二醇，被广泛用于缀合治疗活性分子如蛋白质。通过延长循环时间和降低清除率，这些治疗缀合物已显示可有利地改变药物动力学，降低全身毒性，并且在一些情况下，显示出提高的临床效力。将聚乙二醇PEG共价缀合到蛋白质的方法通常称为“PEG化”。

对于使效力最优化和确保剂量之间的一致性非常重要的是，对于每个分子，缀合到每个蛋白质的缀合聚合物分子的数量是相同的，并且各聚合物分子特异性地共价缀合到每个蛋白质分子的相同的氨基酸残基上。在沿着蛋白质分子的位点上非特异性缀合会导致缀合产物分布，且通常未缀合的蛋白质形成难以纯化且纯化成本高的复杂混合物。

WO 2005/007197公开了一系列新型缀合试剂，所述缀合试剂可用于与蛋白质的亲核基团反应从而产生蛋白质-聚合物缀合物。这些试剂发现特别有用，因为其能够与来自蛋白质中的二硫键的两个硫原子缀合从而形成硫醚缀合物，并且也能用于缀合其它亲核试剂，例如与两个组氨酸残基，例如在与蛋白质连接的聚组氨酸标签中的两个组氨酸残基缀合，如WO 2009/047500中记载的。

对于一些用途，需要将两个聚合物链缀合到蛋白质上，因为含有给定分子量的单链的缀合物的空间性质可明显不同于含例如各具有一半分子量的两条链的缀合物的性质。可用于这种缀合作用的试剂是已知的。因此，例如，US 5,932,462(Harris)公开了能将两条PEG链缀合到蛋白质的试剂。Cong et al，Bioconjugate Chemistry 23(2012)，pp.248-263也公开了能将两条PEG链缀合到蛋白质的试剂，具体地，如第249页图1的试剂3所示的PEG-双砜试剂。在Cong的试剂中，两个PEG链连接到作为苯基基团上的不同位置，所述苯基基团为该试剂与蛋白质反应官能团之间的连接基团。Cong的试剂能够将两个PEG链缀合到，例如，来自蛋白质中的二硫键的两个硫原子，或者缀合到与蛋白质连接的聚组氨酸标签中存在的两个组氨酸残基，其与Harris的试剂相比提供了改良的缀合作用。

现已发现能够将两条聚合物链缀合到蛋白质的新试剂，其显示超越Cong已知试剂的改良性质。

因此，本发明提供通式化合物：

其中每个X独立地代表聚合物链；p代表1-6的整数；Y代表酰胺基；且Z表示-CH.(CH₂L)₂或-C(CH₂L)(＝CH₂)，其中每个L独立地代表离去基团。

式I试剂含有两条聚合物链X。每个聚合物X可为，例如聚(亚烷基二醇)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯如聚(丙烯酰吗啉)、聚甲基丙烯酸酯、聚噁唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺如聚羧甲基丙烯酰胺、或HPMA共聚物。另外，该聚合物可以是一种易受酶降解或水解降解的聚合物。这样的聚合物，例如包括聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚(亚氨基碳酸酯)、以及聚酰胺如聚(氨基酸)。聚合物可以是均聚物、无规共聚物或结构限定的共聚物如嵌段共聚物。例如，它可以是来自两个或更多个环氧烷、或者来自聚(环氧烷)与聚酯、聚缩醛、聚(原酸酯)、或聚(氨基酸)的共聚物，例如嵌段共聚物。所谓的Pluronics是PEG嵌段共聚物中重要的类别。这些都来自环氧乙烷和氧化丙烯嵌段。可使用的多官能聚合物包括二乙烯基醚-马来酸酐与苯乙烯-马来酸酐的共聚物。