[发明专利]使用侧链锚接赖氨酸的胰岛素的固相肽合成

说明书

本申请公开了使用用于固相和液相肽合成的有效方法来制备包括胰岛素和胰岛素衍生物在内的肽。

背景技术

胰岛素以及胰岛素的衍生物和类似物是通过A-链和B-链的固相合成以及双氧化的A-链与线性B-链的随机氧化而高效地合成的。赖氨酸与含赖氨酸的肽通过赖氨酸侧链而附着在酸不稳定的树脂和热不稳定的树脂上。这种方法允许进行多种肽和修饰肽的固相合成。

胰岛素是小型蛋白质，其由2条肽链(A-链和B-链)组成，这2条肽链通过2个分子间二硫键连接在一起。此外，A-链包含其他的分子内二硫键。胰岛素及其衍生物是用于治疗糖尿病的最重要的药品。胰岛素的药物性质可以通过2条肽链的微小修饰而被改变。因此，已经研发多种胰岛素衍生物(图1)，并商业化，例如地特胰岛素(Levemir)、甘精胰岛素(Lantus)、门冬胰岛素(Novolog)、赖脯胰岛素(Humalog)和赖谷胰岛素(Apidra)。

使用仿生方法制备胰岛素是本领域已知的。P.E.Oyer,S.Cho,J.D.Peterson,D.F.Steiner,J.Biol.Chem.1971,246,1375-1386；W.Kemmler,J.D.Peterson,D.F.Steiner,J.Biol.Chem.1971,246,6786-6791。这些方法通过重组DNA技术来制备胰岛素，并且线性的胰岛素原(proinsulin)产物通过氧化而折叠。最终，使用酶除去胰岛素原的中间C-肽，并释放最终的胰岛素。

到目前为止，尽管Zahn,Katsogiannis,Kisho,Kent,the Shanghai Institute,Ciba Geigy,Eli Lilly,Novo Nordisc,Sanofi-Aventis等的研究作了很多努力，但是对于胰岛素而言，仍未研发出化学的经济可行的途径。这些努力均不能以合理的产率和成本生产合成的胰岛素。

目前使用的4种方法为：1)将线性A和B链随机混合，并将它们空气氧化；2)将在半胱氨酸残基的巯基位置处包含磺酸基的A链与磺化的B-链混合；3)在A链和B链之间定点构建3个二硫键；以及4)其中胰岛素原中束缚C肽的功能被Glu(A14)和Thr(B30)的侧链之间的酯键置换的合成方法。该方法需要使用液体氟化氢进行2次反应，以及9次层析纯化，但是该方法是目前被认为最有效的化学合成方法。

在胰岛素及其类似物的化学合成中遭遇的主要困难是：a)A-链和中间保护肽的不溶性，这阻碍了有效的逐步固相合成和纯化；b)使用Fmoc-氨基酸难以合成胰岛素B-链与位置His(BlO)、Leu(Bl1)和Val(B12)处难以进行偶联反应有关[B.Due Larsen和A.HolmJ.Peptide Res.1998,52,470-476]；以及c)在链的结合时获得的产率低。例如方法2(上述)仅得到产率为7％的结合的A和B链。

发明内容

在一个实施方案中，本申请公开了有效方法来克服上述问题，由此能够化学合成胰岛素、其衍生物和其类似物。本申请公开了：1)A链的合成；2)B链的合成；以及3)双氧化的A链与B链的结合。

在一个实施方案中，提供了式I所示的赖氨酸-树脂缀合物，其包含树脂和赖氨酸或赖氨酸衍生物，其中：

W为对于赖氨酸或赖氨酸衍生物由树脂上的切割，酸敏感或热敏感的树脂或对于酸和热均敏感的树脂；