[发明专利]使用离心辅助的感染以增加病毒滴度

说明书

相关申请

本申请要求2012年3月13日提交的美国临时专利申请第61/610,220号的优先权，其整体援引加入本文。

技术领域

本发明涉及增加病毒滴度测定的灵敏度，从而使得病毒原液的计算滴度增加。更具体地，本发明涉及为了最大化感染可能性的目的，使用离心辅助的感染方法以增加病毒或病毒样颗粒与指示细胞单层之间的接触，因而增加测量的病毒滴度。这个增加的病毒滴度在病毒清除研究中计算的对数减少值(LRV)中可以是有益的。

背景技术

生物制药产品如单克隆抗体、重组蛋白、疫苗、血液衍生物和动物产品具有传播感染性病毒的风险。这是由于源材料可能本身污染了病毒或病毒样颗粒。此外，生物制药产品的生产过程易受来自外部来源的病毒污染的影响。结果，生物制药产品的制造者需要在他们的制备过程中加入足够的病毒清除步骤以确保他们的产品不含污染的病毒。这类病毒清除步骤通常包括病毒去除步骤、病毒灭活步骤或这些步骤的组合。生物制药产品的制备过程加入这些病毒清除步骤在安全和监管上势在必行。

在制备过程中评价病毒清除步骤有效性是必需的。病毒清除评价的目的是评估制造生产过程灭活和/或去除潜在的病毒污染物的能力。掺入研究通常用来在生产规模过程的缩小比例模型中评价和证实病毒清除步骤。

通过将病毒加入(或“掺入”)生物制药过程的中间物质来进行掺入研究。然后在制备过程步骤(或“单元操作”)的小型形式中采集物质(或“进料”)。定量单元操作之前和之后进料中病毒的量，并且差异定义步骤的病毒减少。病毒减少通常用log₁₀减少值(LRV)表示。这种类型的研究称作“病毒清除”、“病毒减少”或“病毒验证”。

生物制药产品的监管预期是制备过程提供足够的各种模型病毒的总LRV以确保大量的病毒污染物不可能到达终产物。通过对每个相关过程步骤进行缩小比例的病毒清除研究来获得一种方法的总LRV。然后将获得的每个步骤的LRV加在一起以获得该方法的总LRV。仅“正交”的单元操作LRV可以以这种方式加在一起，表示组成LRV的每个步骤必须通过不同机制消除病毒。

病毒清除研究中最常用来定量病毒污染物的病毒测定是组织培养限制剂量50％(TCID₅₀)、空斑形成单位(PFU)和病灶形成单位(FFU)测定。这些测定中的每一个通过将待测试的物质的稀释液暴露于合适的培养细胞来操作。足够的时间之后，然后通常通过显微镜检查细胞的病毒感染的标志。然后在每个稀释液检测的感染事件的数量用来计算病毒滴度。

一些单元操作对于病毒清除高度有效，并且将病毒减少至一定的点，其中在步骤后物质中未检测到病毒。在这些情况下，认为步骤后物质中的病毒滴度少于或等于病毒测定的检测下限。检测下限取决于测定的物质的量、筛查更大的样品体积降低检测下限。认为在步骤后物质中未检测到病毒，确定的操作的LRV最终仅取决于两个因素：测量/测定病毒存在的物质的量(这决定检测下限)，以及掺入的进料中病毒的滴度。

在掺入的进料中可获得的最大病毒滴度受到病毒原液的滴度的限制。监管指南规定进料不应当掺入高于合并体积的10％的病毒原液体积。此外，病毒掺入对单元操作的性能的影响的实际考虑常将病毒掺入的百分比限制至较低的值。在任何情况下，较高滴度的病毒原液使得能够较高滴度地掺入病毒原液。反过来这表示较高滴度的病毒原液使得能够证实高效病毒清除步骤的较高LRV。

例如，当测量10mL样品时，认为病毒测定的检测下限为0.5log₁₀TCID₅₀/mL。还认为待测试的单元操作为过滤步骤，在整个步骤中不改变物质的体积。由于滤器的限制，进料可以仅掺入最大1％病毒原液。如果病毒原液的滴度为7.0log₁₀TCID₅₀/mL，则1％掺入进料中的滴度为5.0log₁₀TCID₅₀/mL。如果单元操作导致在步骤后物质中未检测到病毒，则报道的LRV为“≥4.5”(5.0-0.5)。但是，如果可获得的病毒原液具有8.0log₁₀TCID₅₀/mL的测量滴度，则报道的LRV为“≥5.5”，表明该步骤去除病毒的大10倍能力的测量证据。