[发明专利]突变的头孢菌素羟化酶及其在脱乙酰基头孢菌烷酸合成中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及具有更好的羟化活性和增加的对式(II)化合物的特异性的经修饰/突变的来自棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的头孢菌素羟化酶，所述式(II)化合物包括但不限于苯乙酰基-7-氨基脱乙酰氧基头孢菌烷酸(苯乙酰基-7-ADCA)和脱乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)。

其中R代表但不限于氢、苯乙酰基、苯氧乙酰基、氨基己二酰基、戊二酰基或任何其他合适的基团。

本发明还描述了通过使用本发明的突变的头孢菌素羟化酶来羟基化对应的式(II)化合物以制备通式I的头孢菌烷酸(cephalosporanic acid)的生物过程，

其中R代表与上文所述相同的基团。所述过程在α-酮戊二酸和抗坏血酸的存在下进行。

本发明还进一步描述了表达和处理用于所述反应的头孢菌素羟化酶的方法。所述修饰的来自棒状链霉菌的头孢菌素羟化酶和用于合成脱乙酰基头孢菌烷酸的生物过程可用于制备7-氨基头孢菌烷酸(7-ACA)、脱乙酰基-7-ACA(7-HACA)、7-苯基乙酰氨基脱乙酰基头孢菌烷酸(苯乙酰基-7-HACA)、7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-头孢菌烷酸-对-甲氧苄酯(p-methoxybenzyl-7-phenylacetamido-3-chloromethyl cepham-4-carboxylate)(GCLE)、7-氨基-3-乙烯基-4-头孢菌烷酸(CAVA)等的方法。

背景技术

β-内酰胺类抗生素例如青霉素和头孢菌素广泛用于多种感染性疾病的治疗。由于头孢菌素提供比青霉素更好的保护作用，特别是在针对耐药菌方面，因此显著地推动了对头孢菌素的衍生化以加宽其广谱性并增强其效能。7-ADCA(7-氨基脱乙酰氧基头孢菌烷酸)、7-HACA和7-ACA充当用于合成大量半合成的头孢菌素(例如头孢拉定、头孢氨苄、头孢羟氨苄(cephadroxyl)、头孢唑林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢西丁等)的核心中间体。目前，7-ACA是通过一种两阶段的酶学过程切割7-氨基己二酰基侧链而由头孢菌素C衍生的(US 5424196)，7-ADCA是通过青霉素G酰胺酶水解苯乙酰基-7-ADCA而衍生的，其中苯乙酰基-7-ADCA是通过对青霉素G的扩环反应的常规化学方法制备。由于7-ADCA或头孢菌素G分别比7-ACA或头孢菌素C价格低，因此实际可行地将在7-氨基位上具有或不具有取代基(例如苯乙酰基基团)的7-ADCA转化为相应的脱乙酰基头孢菌烷酸的方法会提供一种HACA的较廉价的替代品。

天然的青霉素和头孢菌素是由多种细菌和真菌生物产生的，对于它们的调控体系的理解已经取得了显著的进步(Aharonowitz,Y.,et al.,Annu.Rev.Microbiol.46:461-495,1992；Axel A.Brakhage,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:547-585,1998)。三种氨基酸——L-缬氨酸、L-α-氨基己二酸酯和L-半胱氨酸缩合形成三肽——δ-(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸，然后δ-(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸环化形成异青霉素N。对于青霉素生产者，异青霉素N被转化为青霉素G、青霉素V等。通过在生物体(例如顶头孢霉(C.acremonium)、棒状链霉菌等)中将异青霉素N差向异构化为青霉素N来进行的头孢菌素的生物合成，产生了头孢类(cephem)化合物例如头孢菌素C和头孢霉素C。头孢菌素的生物合成过程中的限速或更确切的说，关键步骤是青霉素N的五元噻唑烷环扩环为脱乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)的六元二氢噻嗪环。在原核生物例如棒状链霉菌中，青霉素N的扩环步骤是由被称为脱乙酰氧基头孢菌素C合酶(DAOCS或cefE或扩环酶)的酶催化，DAOC的羟化作用是通过头孢菌素羟化酶(脱乙酰头孢菌素C合酶或DACS或cefF或羟化酶)实施(Jensen S.E.et al.,Journal of Antibiotics,38,263-265,1985)。在真核生物例如顶头孢霉中，这两个反应都是由单独一个双功能酶DAOCS-DACS(扩环酶-羟化酶或cefEF)催化(Dotzlaf,J.E.and Yeh,W.K.,Journal of Bacteriology,169,1611-1618,1987)。随后，脱乙酰基头孢菌素C(DAC)在顶头孢霉中被乙酰化为头孢菌素C，而在细菌例如棒状链霉菌中发生进一步修饰产生头孢霉素C。