[发明专利]脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞的分离和培养方法，尤其涉及一种脐带间充质干细胞亚群的体外培养和扩增方法。

背景技术

干细胞（Stem Cells，SC）是一类具有自我复制能力（self-renewing）的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括脐带血与骨髓。对哺乳动物来说，干细胞分为胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ESC）与成体干细胞（Adult Stem Cell，ASC）两大类，胚胎干细胞取自囊胚里的内细胞团；而成体干细胞则来自各式各样的组织。

成体干细胞，亦称成人干细胞，主要包括骨髓干细胞，脐带血干细胞及周边血干细胞。它们存在于成体特定的组织中，具有干原细胞形成先驱细胞，分化成具特定功能细胞的能力，例如：骨髓干细胞、造血干细胞和神经干细胞。

婴儿出生后遗留在胎盘和脐带中的血是干细胞的重要来源。脐带血中的造血干细胞可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤（如：急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症和淋巴瘤等）、血红蛋白病（如：海洋性贫血）、骨髓造血功能衰竭（如：再生障碍性贫血）、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些实体肿瘤（如：小细胞肺癌、神经母细胞瘤、卵巢癌和进行性肌营养不良等）。自1988年脐血干细胞就用来治疗根达综合症、亨达综合症、和拉综合症和急性淋巴细胞性白血病等许多儿童疾病。截至2011年，脐带血不仅已能有效地治疗几十种难治性疾病和多种不治之症，而且它所能治疗的疾病种类还在不断地增加。自体储存的脐带血一旦需要使用时，不需配型，细胞活性强，无免疫排斥的危险，移植成活率高，治愈率高，医疗费用低。

在人脐带中有一类具有干细胞特征的细胞群体，被称为人间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。人间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，在不同诱导条件下可分化为三胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经细胞等。此外，MSCs还表达IL6、G-CSF和SCF等多种造血细胞生长所需要的因子，能够维持长期培养的造血祖细胞增殖，显示MSC具有支持造血和促进造血恢复的作用。同时研究表明MSC具有免疫调节作用，在体外能够抑制T淋巴细胞增殖，体内动物实验发现MSCs移植可以抑制异体免疫反应，减轻移植相关的排斥反应，并延长异体移植物的存活时间。最近的临床试验发现MSCs联合造血干细胞移植可以减轻GVHD并降低移植失败率。MSC的多向分化能力和免疫调节能力决定了其在细胞治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。

目前常规培养间充质干细胞多用动物血清，动物血清因含有类似于体内环境条件下的多种促细胞生长营养成分和细胞因子，从而成为细胞培养的常规添加成分。常用血清为动物来源血清，如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。

中国发明专利ZL200610067537.5公开了一种脐带间充质干细胞的制备方法，其步骤包括诸如：将人脐带去除残留血液，剪碎，用胶原酶消化；再加入胰酶消化；消化液用筛网过滤，去除未消化组织；将过滤后的消化液用磷酸缓冲液稀释；离心；以及将细胞接种于培养基内进行培养等。

中国发明专利ZL201010568873.4公开了一种脂肪干细胞的分离培养方法，是将荧光激活流式细胞分类和磁激活细胞分选相结合分离培养高纯度脂肪干细胞的技术。分别采用免疫磁珠分选法（采用CD5、CD45R、CD11b、Anti-Gr-1及Ter-119为标记物）除去SVF细胞中的Lin+细胞，获得Lin-细胞群；和流式细胞分选法从获得的Lin-细胞群中富集CD271⁺Sca-1⁺细胞，得到脂肪干细胞；然后将获得的脂肪干细胞用含有LIF、FGF2的培养基培养；免疫磁珠分选法进行分选。