[发明专利]脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其步骤如下：

先将清洗液清洗脐带并破碎，然后加入等体积的0.05w/v%胶原酶于37℃消化后，清洗3次以上，而得脐带间充质细胞。用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入经纯化的CD271一抗，避光孵育，之后用磷酸缓冲液清洗，继续用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入二抗并孵育，再次用磷酸缓冲液液洗，并用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，以流式细胞仪无菌分选。将所得到CD271⁺亚群细胞接种，加入浓度10v/v%的自体脐带血血清，于37℃、5%CO₂扩增培养6天。

2.一种脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其步骤如下：

首先，脐带间充质细胞的获得：

用清洗液清洗脐带并破碎，然后加入等体积的0.05%胶原酶于37℃消化后，获得消化混合物。接着加入磷酸缓冲液清洗并于600g加速度离心15分钟，然后弃上清，再加入磷酸缓冲液，重悬沉淀，过200目筛网，收集滤液，再经450g加速度离心10分钟，并重复4次，即得脐带间充质细胞。

其次，细胞亚群的分选：

将获得的脐带间充质细胞记数，然后用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入经纯化的CD271一抗，避光孵育30分钟；接着用磷酸缓冲液清洗后，继续用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，加入荧光二抗，孵育30分钟；再次用磷酸缓冲液液洗，并用不含血清的α-MEM培养基重悬细胞，以流式细胞仪无菌分选，得到CD271⁺亚群细胞。

最后，细胞体外扩增培养：

CD271⁺亚群细胞接种，加入浓度10v/v%的自体脐带血血清，于37℃、5%CO₂扩增培养6天。

3.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其特征在于所述的磷酸缓冲液还含有1w/v%青霉素和1w/v%链霉素。

4.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其特征在于所述的自体脐带血血清还含有热休克蛋白90。

5.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞体外培养和扩增方法，其特征在于所述的自体脐带血血清还含有浓度50ng/ml热休克蛋白90。