[发明专利]位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽及其在三维定向固定IgG抗体中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽，及其在三维定向固定IgG抗体中的应用，属于基因工程及免疫分析领域。

背景技术

固相免疫测定技术是临床免疫学检验的重要组成部分，如酶联免疫吸附试验及免疫传感器、免疫诊断芯片等新技术，其应用基础是将抗原或抗体包被在固相载体上进行免疫测定，一般包被抗体更为常用。如酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）即是经典的固相免疫测定技术，具有灵敏、简单、快速及易于自动化操作等特点，在生物医学、临床诊断等领域广泛应用，国内外普遍采用聚苯乙烯（Polystyrene,PS）微孔板/管/珠等为固相载体材料且96孔PS微孔板更为常用。目前抗体在PS固相载体表面固相化方法主要有物理吸附法、化学共价交联法及捕获间接包被法等方法。

物理吸附法是应用较早的抗体固相化技术，目前仍有相当普遍的应用。该法原理是通过蛋白质分子结构的疏水基团与固相载体表面疏水基团通过物理吸附结合，这种吸附是非特异性的，存在蛋白吸附能力差及抗体活性低等问题。研究表明通过物理吸附作用直接固定在载体表面的多克隆抗体75%失去抗原结合活性，而单克隆抗体则90%没有抗原结合活性（ButlerJE,etal.MolImmunol.1993,30:1165）。

化学共价交联法主要是通过在载体表面的改性或修饰，引入双功能偶联剂、-NH2等活性基团，使生物分子吸附到PS表面过程由被动的物理吸附变成了共价偶联。共价键依靠不同分子间活性基团的化学反应产生的强相互作用力，如丹麦NUNC公司的氨基化PS微孔板及美国康宁公司的琥珀酰亚胺脂活化酶标板，有效提高了固相抗体（抗原）的结合量。目前认为化学共价法是提高固相材料抗体结合数量相对有效的方法，理论上只要带有合适活性基团的生物活性分子都能通过共价键牢固地结合在固相表面，研究者在载体表面引入不同的活性基团，与蛋白质分子内天然氨基酸残基，或经“ClickChemistry”修饰的某些氨基酸残基共价结合完成抗体的固定。尽管该模式是可控的固定方式，但存在的问题是：参与共价化学键的活性基团在蛋白质分子内的位置有不确定性和不唯一性，不能有效保证抗体定向固定及高免疫学活性。Peter对NUNC公司的高吸附酶标板（MaxiSorp-650）研究发现，尽管抗体包被量达到650ng/cm²，但仅仅只有5～10%的包被抗体具有抗原捕捉能力。

利用抗原-抗体反应捕获待包被抗体，在一定程度上可实现被捕获抗体的定向固定。即将抗-抗体的包被抗体先进行固定；也可采用IgG亲和蛋白如SpA，该蛋白为金黄色葡萄球菌细胞壁的单链多肽，分子量为42kD，能通过疏水作用结合人、兔等多种动物IgG的Fc段，且这种结合不影响IgG的Fab段与抗原特异性结合的免疫活性。在IgG抗体固定化时，SpA可作为受体蛋白先吸附在PS板后，再结合IgG抗体Fc段实现捕获法固定IgG。采用间接包被方式能暴露抗体的抗原结合部位，有利于捕捉体系中的抗原，在一定程度上提高了免疫检测的特异性与灵敏度，但第一抗体或受体蛋白仍采用物理吸附法或化学共价偶联，仍不能有效实现第一抗体或受体蛋白的定向包被固定。

间接包被技术中也可利用生物素-亲和素系统（biotin-avidinsystem，BAS）固定生物素化抗体，该技术以化学共价偶联标记抗体分子内-NH₂、-CHO或-SH等活性位点通过化学法与活化生物素共价偶联得到生物素化抗体，与已包被在聚苯乙烯等固相载体表面的亲和素或链霉亲和素，以生物素-亲和素具有的独特结合特性介导生物素化抗体的固相化。一个抗体分子内存在多个偶联位点，故一个抗体分子可偶联上3～5个生物素分子；尽管亲和素或链霉亲和素的包被方式不是定向固定，然而一个亲和素或链霉亲和素具有4个生物素结合位点，因而其生物素结合位点不易全被掩盖，所以该技术可有效提高抗体的包被量。然而，生物素与抗体分子内的活性基团是一种随机结合方式，当反应基团的氨基酸残基位于抗体Fab或附近时，导致固相化的生物素化抗体的Fc端向外而掩盖Fab段，这样的固相抗体就失去了抗原结合能力（如图1所示）。

抗体在载体表面固定后的空间构型、数量及免疫学活性是影响固相免疫测定技术稳定性、灵敏度和选择性的关键因素，建立一种抗体固定化技术，将抗体的Fc段固定在载体表面，使得Fab端从载体的表面充分向空间展示且抗原结合活性得以完好保持，对于提高固相免疫分析的灵敏性、特异性与稳定性具有重要意义。

发明内容