[发明专利]位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽及其在三维定向固定IgG抗体中的应用

权利要求书

1.一种位点特异性生物素标记的IgG亲和肽，是在IgG亲和肽的羧基端以生物学方式连接生物素构建而成。

2.权利要求1所述的位点特异性生物素标记的IgG亲和肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）根据(Gly₄-Ser)₃及Avi基因序列，化学合成(Gly₄-Ser)₃-Avi的基因片段，重组至pUC18载体，获得中间质粒载体；

（2）设计引物以PCR方式获得IgG亲和肽基因，重组至上述中间质粒载体，获得原核表达载体；

（3）原核表达载体转化感受态大肠杆菌BL21，获得基因工程菌；

（4）培养基因工程菌，培养基中含有生物素，依菌体内BirA酶同步催化，在所表达的目的蛋白的Avi序列的赖氨酸位点结合生物素；

（5）纯化目的蛋白，获得生物素定点定量连接的IgG亲和肽。

3.根据权利要求2所述的位点特异性生物素标记的IgG亲和肽的制备方法，其特征在于：步骤如下：

（1）根据Avi-tag氨基酸序列，化学合成其基因序列，并在其5′端置入柔性蛋白Linker：(Gly₄-Ser)₃的基因序列，得(Gly₄-Ser)₃-Avi-tag基因序列，并分别在该重组基因片段上下游置入PstI、HindIII酶切位点，酶切插入pUC18载体，得中间质粒载体；

（2）表达载体及基因工程菌的构建：

①设计引物PCR扩增ZZ亲和肽基因，并插入到上述中间质粒载体的EcoRI、PstI位点，构建得到重组表达载体pUCZZ-(Gly₄-Ser)₃-Avi-tag；

②上述重组表达载体CaCl₂转化感受态大肠杆菌BL21，氨苄LB抗性平板筛选阳性克隆，获得基因工程菌；

（3）基因工程菌的培养及体内生物素化：

①挑取单克隆菌落接种于5mL液体LB培养基，37℃过夜培养、活化；

②活化菌液按照2%的接种量转接于新鲜的50mL液体LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.3时，在培养基中加入终浓度为50μM的生物素，继续培养16h，依大肠杆菌菌体内BirA酶同步催化所表达的目的蛋白在Avi序列赖氨酸位点结合生物素；

（4）融合蛋白的提取：

①经上述培养的基因工程菌4℃，1000rpm离心10min，收集菌体；

②菌体以5mL0.1M的Tris缓冲液重悬，置入-80℃液氮中10min，再迅速置入37℃的恒温水浴中15min，如此反复冻融3次；

③上述反复冻融的菌液4℃，1200rpm离心10min，上清转入一新离心管中；

（5）目的融合蛋白的纯化：

①清洗柱子：用2柱体积的BufferA清洗Strep-Tactin柱；

②样品上柱：取步骤（4）冻融的菌液上清5mL流通上柱结合目的蛋白；

③冲洗柱子：用5柱体积的BufferA洗柱，并收集每部分的洗脱液；

④目的蛋白的洗脱：以BufferB洗脱目的蛋白；

⑤目的蛋白的脱盐与浓缩：使用Millipore超滤器，4℃，4000rpm，离心30min浓缩，既得定点定量生物素标记的ZZ亲和肽。

4.权利要求1所述的位点特异性生物素标记重组IgG亲和肽在三维定向固定IgG抗体中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：应用时，方法为：（A）首先，将位点特异性生物素标记的IgG亲和肽与预包被亲和素或链霉亲和素的聚苯乙烯载体以生物素-亲和素结合特异性定向吸附固定；（B）然后再利用IgG亲和肽与IgG抗体的特异性结合将IgG抗体Fc端结合到IgG亲和肽上。