[发明专利]一种高效、低毒的石墨烯多功能载体的构建及其制备方法

权利要求书

1.一种用于研究蛋白质作用机制的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是可同时实现基因转染、生物活性分子输送、蛋白质纯化三种功能中的任意两种或两种以上功能。

2.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：以超小尺寸氧化石墨烯为基本载体，超小尺寸的氧化石墨烯尺寸需小于500nm。

3.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：使用高分子或阳离子高分子提供基因负载和转染能力，并提供反应性大量官能团NH2。

4.根据权利要求3所述的阳离子高分子包含聚乙烯基亚胺(PEI)、聚酰胺-胺树形高分子(dendrimer)、脱乙酰壳多糖(chitosan)、阳离子聚磷酸酯、聚乙烯基吡啶盐、聚(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯。

5.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：使用多臂聚乙二醇增加载体的溶解性、生物相容性、延长载体活性成分在细胞内的酶降解半衰期、并减小毒性。

6.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：使用亲和性分离基团可专一性识别其标记的目标蛋白质，提供纯化功能。

7.根据权利要求6所述的亲和性分离基团包含链酶亲和素、6倍组氨酸(6XHis)、谷胱甘肽S-转移酶与谷胱甘肽。

8.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体，其特征是：可使用牛血清蛋白或鸡血清蛋白减少或消除非目标蛋白质的非专一性吸附，提高目标蛋白质纯度。

9.根据权利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能载体的制备，包含以下步骤：

(1)制备权利要求2所述的超小尺寸氧化石墨烯：选取纯度99.95％以上的鳞片石墨，根据改进的Hummer’s法制备氧化石墨烯；然后超声分散于MilliQ水中，使用离心过滤膜过滤，MilliQ水洗涤，得到权利要求2所述的超小尺寸氧化石墨烯(尺寸小于500nm)；

(2)进行阳离子高分子的功能化：将步骤(1)制得的超小尺寸氧化石墨烯分散于MilliQ水中，加入超支化PEI、6臂聚乙二醇、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌后使用离心过滤膜过滤、MilliQ水洗涤，得到载体1；

(3)进行生物素的功能化：将步骤(2)制得的载体1加入生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌过夜，使用离心过滤膜过滤，MilliQ水洗涤，得到载体2；

(4)进行功能性多肽的功能化：将步骤(3)制得的载体2加入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)，溶解在DMSO中，室温下反应2h；之后使用离心过滤膜过滤，MilliQ水／DMSO混合液洗涤，分散于PBS缓冲液中；加入三羧乙基膦，搅拌反应24h；使用离心过滤膜过滤，PBS缓冲液洗涤，得到载体3；

(5)进行链酶亲和素的功能化：将步骤(4)制得的载体3在2h内使用蠕动泵缓慢滴加到上述链酶亲和素与PBS缓冲溶液中，混合；使用离心过滤膜过滤，PBS缓冲液洗涤，分散于PBS缓冲液中，得到载体4；

(6)将步骤(5)制得的载体4加入血清蛋白，溶解于PBS缓冲液中，孵育1h，即完成血清蛋白在该多功能载体上的物理吸附，得到最终的高效、低毒的石墨烯多功能载体。