[发明专利]一株抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌HLJ-66及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株对抗Btk小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）HLJ-66菌株，以及在制备杀虫剂中的应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt），是土壤中的一种能够产生芽孢的需氧型革兰氏阳性细菌。1901年Ishiwate等首次从患病的家蚕(Bombyx morl)幼虫当中分离出一种能够在其芽孢的形成阶段，产生晶体蛋白的细菌，1915年Berliner等在地中海粉螟(Epetia kuhniella)中也成功分离出这种细菌，同时将其命名作苏云金芽孢杆菌-Bt.thuringiensis。苏云金芽孢杆菌在其芽孢的形成过程当中，能够产生一种杀虫晶体毒素蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，δ-内毒素)，这种晶体蛋白对鳞翅目(Lepidoptera)昆虫、同翅目(Homoptera)昆虫、鞘翅目(Coleoptera)昆虫、双翅目(Diptera)昆虫、膜翅目(Hymenoptera)昆虫、直翅目(Orthoptera)昆虫等多个目的昆虫，同时包括对原生动物、螨类以及线虫等都具有特异性地杀虫活性，由于这种晶体蛋白对害虫高效、对非靶标生物安全以及对环境友好，因此在整个世界范围内得到了广泛的应用。该菌菌剂作为喷洒型杀虫剂主要成分的使用时间已经超过50年，是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的90%-95%。

苏云金芽孢杆菌的不同杀虫毒素由不同种类的cry基因控制，各种cry基因已经被成功克隆，并根据不同需要，利用转基因技术转入到不同作物中，用于害虫等有害生物的防治。自1996年转Btcry基因作物的种植开始，转Bt基因作物在世界范围内被广泛种植，种植面积逐年增长。据2008年的统计显示，转Bt基因作物的种植面积已增长至4,600万公顷。

但随着其长期使用及转Bt作物的迅速推广，害虫对Bt毒素的抗性已成为不容忽视的问题。随着Bt毒素的大量长期使用以及转Bt作物的广泛种植，昆虫长期处于选择压之下，从而导致了昆虫都Bt的抗性发展。通过室内筛选，发现许多昆虫对Bt毒素产生了抗性，例如印度谷螟Plodia interpunctella、烟蚜夜蛾Heliothis virescens、小菜蛾Plutella xylostella、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis、棉红铃虫Pectinophora gossypiella、棉铃虫Helicoverpa armigera。1990年，Tabashnik等报道田间小菜蛾对Bt制剂产生了抗性，这是第一例关于害虫在田间对Bt制剂产生抗性的报道；Janmaat等于2003年报道，加拿大不列颠哥伦比亚商业化大棚里的粉纹夜蛾对Bt制剂Dipel和Abbott产生了抗性。Tabashnik等于1989年检测到田间种群对Bt制剂（kurstaki亚种）产生了25倍的抗药性，首次报道了田间小菜蛾对Bt杀虫剂产生了抗药性。Tang等测定弗罗里达州田间小菜蛾对Bt制剂（BtKNRD12）的抗药性大于1500倍。Wright等报道马来西亚田间小菜蛾种群在室内筛选饲养7代后对BtA和BtK制剂的抗药性分别为330倍和160倍。此外，日本、中美洲、墨西哥和印度等国家和地区也有抗Bt小菜蛾的报道。2000年Zhao等报道从美国南卡罗尼那州田间采集的对Cry1C有31倍抗性的小菜蛾抗性品系，在实验室先用Cry1C原毒素继续汰选，然后用表达高剂量的Cry1C毒素的转基因花椰菜汰选，26代后，该品系对Cry1C毒素抗性高达63100倍（2龄幼虫）。国内，冯夏等报道深圳、东莞地区等供港菜区小菜蛾对Bt的抗药性为17.2-30.2倍。李建洪等通过对深圳、东莞和广州菜区的田间小菜蛾种群检测，发现小菜蛾对苏云金芽孢杆菌标准品Cs3ab-1991的抗药性倍数分别为8.9、6.5、2.1倍。周程爱等报道长沙地区的小菜蛾对Bt的抗药性由1997-1999年的敏感性由1.1-4.1倍发展到2000年的6.2倍的低水平抗药性。余德亿等报道福建地区田间种群的小菜蛾对湖北Bt和福建Bt的抗药性分别由1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世俭等报道浙江省杭州、萧山、金华、温州四地的小菜蛾对Bt制剂还没有产生抗药性。王崇利等报道广东惠州田间小菜蛾种群对Cry1Ab和Cry1Ac的抗性达到了高抗水平；对Btk制剂的抗性达到了中抗水平；对Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小菜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac具有低至中等水平抗性（8-28倍），对Btk制剂具有低水平抗性（3.5-7倍）。