[发明专利]一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种检测试剂盒，特别是一种采用增强胶乳免疫比浊法检测人尿液中纤维连接蛋白又称纤维结合蛋白（FN）浓度的试剂盒及其方法。

背景技术

纤维连接蛋白又称纤维结合蛋白（Fibronectin，简称FN），有两条相类似的多肽链亚基组成，亚基的分子量为220-250KD。现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定尿液中纤维连接蛋白（FN）浓度，其缺点为操作繁琐、工作强度大、保持时间长，一般需8-48小时、其定量的精确度差。

因尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度低，所以国内外至今未见有用本试剂盒及方法的报导。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法，所述的这种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒及其方法要解决现有技术中采用免疫扩散法和ELISA双抗体夹心技术测定尿纤维连接蛋白（FN）浓度过程复杂，准确性不高的技术问题。

本发明提供了一种用于检测尿液中纤维连接蛋白浓度的试剂盒，包括两种试剂，Ⅰ试剂由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、PEG6000-8000、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-NA₂）和曲拉通100（TX-100）组成，在所述的Ⅰ试剂中，所述的磷酸氢二钠的质量百分比浓度为28.6g/L，所述的磷酸二氢钾的质量百分比浓度为2.7g/L，所述的PEG6000-8000的质量百分比浓度为50g/L，所述的EDTA-NA₂的质量百分比浓度为1g/L，所述的TX-100的体积浓度为0.2ml/L，Ⅱ试剂是兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体交联在胶乳颗粒上构成的悬浊液。

进一步的，所述的II试剂是利用碳二亚胺反应将兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或纯化后的鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体IgG共价结合到胶乳颗粒上。

具体的，胶乳颗粒的直径为60－160nm，材料为聚苯乙烯。

具体的，上述的曲拉通100的纯度为100％。

进一步的，所述的兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清的效价为1:64。

本发明还提供了一种检测人尿液中纤维连接蛋白（FN）浓度的方法,采用上述的试剂盒，包括一个将尿样本采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将尿样本采用生化分析仪测定的步骤中，将尿样品加入第一种试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点样本A1，加入第二种试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点样本A2，样本A=样本A2-样本A1；还包括一个将尿校准品采用生化分析仪测定的步骤，在所述的一个将尿校准采用生化分析仪测定的步骤中，将尿校准品加入第一种试剂R1后，37℃孵育5min，读测第1点校准A1，加入第二种试剂R2，37℃孵育5min，读测第2点校准A2，校准A=校准A2-校准A1；

结果计算：

上述测定的参数为（增强乳胶免疫比浊法）：温度37℃,主波长546nm或600nm、副波长700nm，尿样本或校准品3-4μl,R₁：240μl,R₂：60μl，反应时间为10分钟。

本发明的兔抗人纤维连接蛋白抗血清、或羊抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白抗血清、或鼠抗人纤维连接蛋白单克隆抗体可以在市场购买，也可以通过常规的免疫方法制备，化学试剂由市场购备。

本发明是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆或多克隆纤维连接蛋白单（FN）抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，增加了溶液中反应浊度，即透光度减少，吸光度增加反应人尿液中纤维连接蛋白单（FN）的浓度。

本发明的试剂盒和方法是采用增强胶乳免疫比浊法的测定原理，即利用纤维连接蛋白（FN）抗原和特异性抗体（兔抗人纤维连接蛋白（FN）抗血清）相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生浑浊，其浊度高低，即透光度减少、吸光度增加反映人尿液样本中纤维连接蛋白（FN）的浓度，尿纤维连接蛋白（FN）的浓度可由校准品所作的剂量反应曲线算出。

采用本发明的试剂盒和方法测得的尿液中纤维连接蛋白（FN）的浓度可以作为科研和教学及临床使用。