[发明专利]干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，属于医学生物技术领域。 

背景技术

脊髓损伤是造成人体截瘫的主要原因，一直是神经外科研究的重点和难点。脊髓损伤的病理生理过程包括脊髓原发性损伤、继发性损害和脊髓修复三个阶段。脊髓原发性损伤是受伤当时物理性损伤造成的神经细胞的死亡。脊髓继发性损害的机制包括血液循环障碍、生化活性物质改变及能量代谢障碍等多个方面，其核心问题是组织的缺血缺氧。脊髓损伤后功能的丧失是由于神经细胞的死亡、上行和下行轴突的中断以及缺乏有效的再生。最近的研究表明轴突再生的失败是由于损伤部位存在阻碍轴突再生的疤痕组织及抑制性分子、被切断的轴突缺乏营养支持和轴突被切断后的内在性神经细胞改变包括细胞变性及死亡。脊髓损伤治疗主要包括提供受损轴突生长允许性微环境、增强被切断轴突的神经细胞的再生作用二大方面。过去所采用的方法包括脊髓内移植胚胎组织、外周神经、原代细胞、细胞系;以及应用营养因子、促使生长相关基因过度表达等。但是，单纯应用一种方法并不能得到满意的脊髓功能恢复，而联合应用多种方法已经显示出良好的脊髓功能恢复。

近来，从胚胎、成体脑和脊髓中分离出的神经干细胞引起了我们极大的兴趣，包括胚胎干细胞、多能干细胞、祖细胞、定向祖细胞。自我更新和多种分化潜能是神经干细胞的二种基本属性。 

发明内容

本发明提供了一种稳定的干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法。

为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，包括有以下步骤：

（1）胚胎大鼠脊髓神经干细胞的分离和扩增

 严格无菌条件下，在DMEM细胞培养基中取出胚胎大鼠脊髓，用HBSS冲洗，剪碎，移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生长细胞培养基，用吸管吹打制成单细胞悬液，移入培养瓶；原代细胞克隆形成后再次机械分离制成单细胞悬液，每7-10天传代一次，方法同前；低温保存时，全生长细胞培养基中加入10%DMSO；在传代同时并进行克隆形成实验，用免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM 确定细胞类型；

（2）依赖EGF和FGF的神经球细胞在不同外源性因子作用下的培养及分化

依赖EGF和FGF的神经球细胞转移到12孔细胞培养板，在EGF或FGF和以下一种或数种因子联合作用下培养4-8天：PDGF、NT-3、BDNF、NGF、EGF、FCS、FGF、顺式视黄酸；免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM 、NeuN确定细胞类型；

（3）含HIF-1α、BDNF序列的重组腺相关病毒的构建

 1）鼠HIF-1α的克隆：鼠肝癌细胞系Hepalclc7^提取 总RNA^RT-PCR HIF-1αcDNA（核心序列约2.5Kb）^{酶切连接质粒}重组质粒—转化细菌—筛选菌落，

 2）质粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供，转化细菌—筛选菌落，

 3）目的基因的阳离子脂质体的包装和测定，

 4） 表达载体的鉴定：酶切、琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺电泳分析HIF-1α、GDNF基因并验证其表达的正确性；

（4）大鼠脊髓神经干细胞的体外转染及分析：含目的基因的阳离子脂质体与培养的神经干细胞共同孵育1小时，然后置于含G418的细胞培养板培养24小时，收集新霉素抗性克隆；台盘蓝染色，至移植时，在HBSS中分离成单细胞悬液，重新放于全生长细胞培养基，确定细胞活性及密度为10⁵细胞/μl，移植后，剩余的细胞行组织化学法及免疫细胞化学法检测类型等，并检测β-gal与GDNF、HIF-1α表达的相关性；

（5）表达产物的测定和生物活性分析：采用Western blot法和Slot blot法验证GDNF、HIF-1α的表达，应用E8鸡胚DRG检测GDNF的生物活性；采用Western blot法、免疫组织化学法从蛋白质水平测定HIF-1α的生物活性。