[发明专利]干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法

权利要求书

1.干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，包括有以下步骤：

（1）胚胎大鼠脊髓神经干细胞的分离和扩增

 严格无菌条件下，在DMEM细胞培养基中取出胚胎大鼠脊髓，用HBSS冲洗，剪碎，移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生长细胞培养基，用吸管吹打制成单细胞悬液，移入培养瓶；原代细胞克隆形成后再次机械分离制成单细胞悬液，每7-10天传代一次，方法同前；低温保存时，全生长细胞培养基中加入10%DMSO；在传代同时并进行克隆形成实验，用免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM 确定细胞类型；

（2）依赖EGF和FGF的神经球细胞在不同外源性因子作用下的培养及分化

依赖EGF和FGF的神经球细胞转移到12孔细胞培养板，在EGF或FGF和以下一种或数种因子联合作用下培养4-8天：PDGF、NT-3、BDNF、NGF、EGF、FCS、FGF、顺式视黄酸；免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM 、NeuN确定细胞类型；

（3）含HIF-1α、BDNF序列的重组腺相关病毒的构建

 1）鼠HIF-1α的克隆：鼠肝癌细胞系Hepalclc7^提取 总RNA^RT-PCR HIF-1αcDNA（核心序列约2.5Kb）^{酶切连接质粒}重组质粒—转化细菌—筛选菌落，

 2）质粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供，转化细菌—筛选菌落，

 3）目的基因的阳离子脂质体的包装和测定，

 4） 表达载体的鉴定：酶切、琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺电泳分析HIF-1α、GDNF基因并验证其表达的正确性；

（4）大鼠脊髓神经干细胞的体外转染及分析：含目的基因的阳离子脂质体与培养的神经干细胞共同孵育1小时，然后置于含G418的细胞培养板培养24小时，收集新霉素抗性克隆；台盘蓝染色，至移植时，在HBSS中分离成单细胞悬液，重新放于全生长细胞培养基，确定细胞活性及密度为10⁵细胞/μl，移植后，剩余的细胞行组织化学法及免疫细胞化学法检测类型等，并检测β-gal与GDNF、HIF-1α表达的相关性；

（5）表达产物的测定和生物活性分析：采用Western blot法和Slot blot法验证GDNF、HIF-1α的表达，应用E8鸡胚DRG检测GDNF的生物活性；采用Western blot法、免疫组织化学法从蛋白质水平测定HIF-1α的生物活性。