[发明专利]人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及极长链脂肪酸检测的技术领域，特别是一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法。

背景技术

体内的超长链饱和脂肪酸VLCFA（very-long-chain fatty acids）主要包括二十二烷酸（C22:0）、二十四烷酸（C24:0）和二十六烷酸（C26:0）3种，它们只能在过氧化物酶体中进行β-氧化。VLCFA在体内主要以酯的方式存在，包括甘油三酯、磷脂、糖脂等，但是也有少部分以游离方式或游离方式结合血清白蛋白存在。

测定血清中VLCFA的含量，可以用来辅助诊断疑似过氧化物酶体代谢失调相关的遗传代谢性疾病，包括过氧化物酶体生源性失调、X-连锁肾上腺脑白质营养不良以及过氧化物酶体功能评价等。

目前，广泛使用的人血清中极长链脂肪酸的检测方法为气相色谱（GC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS），因为使用GC和GC-MS要求检测的化合物必须挥发性强，热稳定性好，因此，极长链脂肪酸在上机检测之前，必须进行相应的前处理，使其转化成为适合GC和GC-MS检测的化合物，这也就导致极长链脂肪酸的前处理过程复杂，分析时间较长，应用时具有一定的局限性。

目前，国内外使用最广泛的前处理方法就是将脂肪酸进行硅烷衍生化或甲酯化反应，生成硅烷化产物或者甲酯化产物，然后进GC或GC-MS检测。

硅烷衍生化的前处理步骤：首先进行水解，将在体内以酯化方式存在的极长链脂肪酸水解出来，采用非极性的溶剂萃取游离的脂肪酸，氮气吹干之后，加入衍生化试剂反应，衍生化产物上机测定。

甲酯化的前处理步骤分为两种：一种为采用有机溶剂将游离的脂肪酸及以酯化状态存在的脂肪酸使用非极性溶剂或者混合溶剂萃取之后，加入甲酯化试剂，其中游离的脂肪酸进行甲酯化反应，酯化状态的脂肪酸发生转甲酯化反应，然后采用正己烷萃取甲酯化的产物，氮气吹干，复溶后检测；另一种为直接在样品中加入甲酯化试剂，游离的脂肪酸进行甲酯化反应，结合状态的脂肪酸进行转甲酯化反应，然后采用有机溶剂萃取甲酯化的产物，氮气吹干，复溶后检测。

由于血清中含有大量非极性的甾醇类，在采用非极性的有机溶剂萃取脂肪酸时，会同时萃取到大量的甾醇类杂质，这些甾醇类化合物上机检测，所得的响应非常高，干扰到目标化合物在色谱柱上的分离分析，因此在前处理过程中去除甾醇类杂质的干扰必不可少。

针对甾醇类杂质的去除，在采用硅烷衍生化方法时，在水解之后将溶液加盐酸酸化，使用正己烷萃取，这一步同时将脂肪酸和非极性的甾醇类化合物萃取出来，然后再加入氢氧化钾，使脂肪酸发生皂化反应，以离子化状态存在于水相层，而没有羧基的甾醇类杂质由于没有发生皂化反应，仍然留在了有机相层，通过将有机相层弃除，来除掉大部分的甾醇类杂质，然后在水相层中再次加入盐酸，使离子化的脂肪酸呈现游离状态，加入正己烷萃取，氮气吹干，进行衍生化反应，该方法步骤繁琐，操作复杂，萃取效率低，不利于得到稳定的结果。而使用甲酯化反应的前处理方法中没有涉及到甾醇类化合物去除的步骤。

由于目前报道的测定血清中极长链脂肪酸的前处理方法都非常复杂，因此建立一种快速、灵敏、准确的前处理方法就显得尤为重要。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题是提供一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法，前处理过程快速、灵敏、准确。

为了解决上述问题，本发明公开了一种人血清中三种极长链脂肪酸的气相色谱-质谱检测方法，所述方法包括：

（1）、人血清样品前处理得到衍生化产物，包括：

在人血清中加入十七烷酸和二十七烷酸的混合内标溶液，再加入盐酸-乙腈溶液，充分混匀后在设定为80～120℃的烘箱中酸水解；

将酸水解后的溶液静置冷却至室温，加入氢氧化钠-甲醇水溶液，充分混匀后在设定为80～120℃的烘箱中碱水解；

将碱水解后的溶液静置冷却至室温，加入正己烷萃取甾醇类杂质，弃除上层溶液，加入盐酸至溶液的pH值显酸性；

加入正己烷并充分混匀，离心后取出上层溶液用氮气吹干，在残渣中加入衍生化试剂，置于70～90℃的烘箱中进行衍生化反应得到衍生化产物；

（2）、对所述衍生化产物用气相色谱-质谱仪进行检测；

其中，气相色谱条件包括：

色谱柱：30m×0.25mm×0.25μm；

载气：氦气，99.999%；

载气流速：1.0mL/min；

进样方式：不分流进样；

进样体积：1μL；