[发明专利]一种热稳定性好的β‑葡聚糖酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶制剂制备技术领域，特别是一种高产热稳定性好的β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌。

背景技术

β-葡聚糖是一种天然多糖，通常存在于特殊种类的细菌、酵母菌及真菌的细胞壁，或者高等植物种子的包被中。β-葡聚糖是构禾本植物细胞壁的一种结构性非淀粉多糖，在大麦、黑麦、高粱、大米及小米的胚乳细胞壁中含量尤其高。与一般糖类主要以α-1，4-糖苷键结合而成为线形分子不同的是，植物细胞壁中的β-葡聚糖是以混合的β-（1,3），（1,4）糖苷键连接形成的D型葡萄糖聚合物，因此β-葡聚糖可以以很大的分子量溶解于水中，从而具有粘度大、亲水性高、吸水膨胀力和持水性高的性质。当以大麦作为啤酒生产原料时，上述性质便会影响麦芽汁的过滤速度，降低固形物的浸出率，还会因凝胶沉淀作用而降低啤酒的品质；同时当含有β-葡聚糖的作物用作饲料时，会增加非反刍禽畜的肠液粘度，成为饲料的抗营养因子之一，降低饲料的利用率。

β-葡聚糖酶是高效、专一分解β-葡聚糖的主要酶，在啤酒和饲料的生产过程中添加该酶能有效的解决上述问题。在饲料工业中它能水解β-葡聚糖中的1-3或1-4糖苷键，使之降解为低分子糖，降解后的β-葡聚糖市区亲属性和粘性，不会在畜禽肠道中膨胀粘连，使得食糜的消化率以及饲料的能量利用率均得到提高。β-葡聚糖酶应用于啤酒生产中，可以转移分解粘度很高的各种大麦β-葡聚糖，疏松大麦胚乳细胞壁，促进细胞内容物的外溢，提高原料利用率，降低麦芽汁粘度，从而使啤酒产量增加，品质得以提升。

目前，美国、日本、丹麦、德国、澳大利亚、加拿大等国均已采用β-葡聚糖酶作为啤酒和饲料工业的主要酶制剂，而其在医药、纺织、废水处理和日用化工、生物防治等其他方面的应用价值也逐渐显现出来，前景十分广阔。但是热稳定性差和酶活力低已经成为影响其应用效果的制约因素。

中国专利CN103013873A公开了一株产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株，该发明首次提供了一株来源于温泉的能够生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高地芽孢杆菌，并克隆得到了该酶的基因，该酶在60℃条件下保存1h后仍能保持90%的酶活力。

中国专利CN102719416A提供了一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法，通过HNO₂对β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行化学修饰，所得的β-1,3-1,4-葡聚糖酶T₅₀值和t_{（1/2,60℃）}分别提高了4.76%和62.1%。

之前，市场上高品质的β-葡聚糖酶几乎被国外的酶制剂生产公司所垄断，虽然近几年我国所报道的微生物产β-葡聚糖酶的酶活力已达到甚至超过了国际水平，但是能够获得兼具高活性及热稳定性的β-葡聚糖酶及其生产菌株仍然是目前工业应用中亟待解决的一大问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法。

本发明提供的产热稳定性好的β-葡聚糖酶的菌株具体为地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10-25。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院），保藏号为CCTCC NO：M2013538。

所述地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10-25特点如下：

所述菌株在固体平板上菌落为白色，边缘不整齐，表面干燥不透明，镜检为革兰氏阳性细菌，细胞形态呈短杆状，芽孢中生，椭圆形，不膨大。

所述菌株生理生化特征：V-P试验（+），淀粉水解（+），酪素水解（+），明胶水解（+），硝酸盐还原（+），吲哚试验（-），利用柠檬酸盐（+），硝酸还原（+），甘露醇（+），木糖（+）。

一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：

（1）种子培养

将β-10-25斜面菌种经三级摇瓶发酵剂一级种子罐发酵；

所述种子培养的培养基为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％，pH4.5-7.0，121-123℃灭菌30-40min。

（2）发酵罐发酵