[发明专利]一种降解获得及检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药领域涉及一种降解获得及检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法。

背景技术

硫酸软骨素(CS)是一类由糖醛酸(葡萄糖醛酸，GlcA或艾杜糖醛酸，IdoA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)为二糖重复单元组成的有硫酸根修饰的线性高分子多糖，GlcA与GalNAc以β-1，3糖苷键相连，IdoA与GalNAc以α-1，3糖苷键相连，双糖单位之间由β-1，4糖苷键相连，包括硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素B(CSB)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素D(CSD)和硫酸软骨素E(CSE)等。已有相关的药物或是保健品上市，如硫酸软骨素片、硫酸软骨素注射液、硫酸软骨素滴眼液、硫酸软骨素胶囊等。不同种类的硫酸软骨素硫酸化程度及硫酸根位置不同，CSA的二糖单位是GlcA-GalNAc4S，主要来源于软骨；CSB的主要二糖单位是IdoA-GalNAc4S，来源于皮肤；CSC的二糖单位是GlcA-GalNAc6S，来源于鲨鱼软骨；CSD的二糖单位是GlcA2S-GalNAc6S，来源于海胆。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是糖胺聚糖中的一种，属于酸性粘多糖，广泛分布于人体各部位。透明质酸是由葡萄糖糖醛酸(GlcA)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)为二糖重复单元组成的高分子线形多糖。GlcA与GlcNAc之间由β-1，3糖苷键相连，双糖单位之间由β-1，4糖苷键相连。分子中两种单糖按1∶1的摩尔比组成，双糖单位可达25000之多，在体内透明质酸的分子量从5KDa到20000KDa不等。透明质酸有多种生物功能，已被开发成多种药物用于眼睛外科手术、关节修复注射液、伤口愈合、外科手术防粘剂等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用。透明质酸由于其具有独特理化性质和生理功能，在生物材料方面亦得到了广泛应用。

分析不同类型的CS和HA，主要是对其二糖组成进行分析。传统的分析方法是用相应的裂解酶，如硫酸软骨素酶ABC降解，通过强阴离子交换柱分离不同二糖，与市售的二糖标准品比对保留时间进行定性，再通过各二糖标准品对检测器响应值和物质的量的标准曲线进行含量分析，从而确定该多糖的结构。如王皓等采用离子交换色谱从Wistar大鼠肾脏中提取糖胺聚糖，用软骨素酶ABC降解糖胺聚糖中的硫酸软骨素组分，对二糖组成分析(王皓，于广利，赵峡，等.大鼠肾脏糖胺聚糖的种类及二糖组成分析[J].光谱学与光谱分析,2010(9)：2484～2487.)。对于透明质酸的分析，鲍伦军等建立了一种用软骨素酶ABC酶解-高效液相色谱测定鱼翅中的HA的方法(鲍伦军，杨建成，何振华，等.软骨素酶ABC酶解高效液相色谱法测定鱼翅中的透明质酸[J].色谱,2002(06)：557～559.)。但是用酶降解硫酸软骨素时，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)脱水后形成结构相同的脱水糖醛酸，从而失去了硫酸软骨素中葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)的相对含量信息，而且裂解酶不能将CS或HA完全降解为二糖。酶、强阴离子交换柱和二糖标准品都非常昂贵，并且酶容易失活、性质不稳定，检测步骤繁琐，样品消耗量大，检测时间长，分析结果的重复性差。所以亟需一种高效、操作简单、稳定的检测CS和HA二糖的方法。

发明内容

针对以上现有技术存在的不足，本发明提供一种全面、高效、简单、稳定且成本低的检测硫酸软骨素二糖和透明质酸二糖的方法，本发明的另一目的是提供一种可将硫酸软骨素和透明质素完全降解为相应二糖化学降解方法。

实现上述发明的技术方案是：

1.一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，包括如下步骤：

(1)将硫酸软骨素或透明质酸脱乙酰化，得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸；

(2)将步骤(1)所得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸亚硝酸降解，得硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖；

(3)将步骤(2)所得二糖浓缩至干，溶解于水中，调节pH值为碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除多余的衍生试剂；

(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。

步骤(3)衍生反应方程式为：

当X＝H，Y＝H时，反应物为PMP；当Y＝H，X＝D时，反应物为D3PMP；当Y＝D，X＝H时，反应物为D5PMP；当Y＝D，X＝D时，反应物为D8PMP。式中的二糖可以是以下提到的任意二糖。

2.一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：