[发明专利]一种降解获得及检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法

权利要求书

1.一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将硫酸软骨素或透明质酸脱乙酰化，得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸；

(2)将步骤(1)所得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸亚硝酸降解，得硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖；

(3)将步骤(2)所得二糖浓缩至干，溶解于水中，调节pH值为碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除多余的衍生试剂；

(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。

2.如权利要求1所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：

将硫酸软骨素或透明质酸溶于含有N₂H₄·H₂SO₄的N₂H₄·H₂O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到90-110℃，反应5-16h，反应完成后，冻干，除去N₂H₄得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸。

3.如权利要求1所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：

将硫酸软骨素或透明质酸溶于含有N₂H₄·H₂SO₄的N₂H₄·H₂O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应9h，反应完成后，冻干，除去N₂H₄得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸。

4.如权利要求1所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的亚硝酸降解反应步骤包括：

将脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖。

5.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤中硫酸软骨素或透明质酸与N₂H₄·H₂O溶液的质量体积比(mg/mL)为1∶0.5-1，N₂H₄·H₂O溶液中含10％N₂H₄·H₂SO₄。

6.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(2)所述的亚硝酸降解步骤中脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸水溶液与亚硝酸钠水溶液、亚硝酸、氨水的体积比为1∶1∶1∶0.6。

7.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖与吡唑啉酮类衍生试剂的质量比为1∶6-60。

8.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的吡唑啉酮类衍生试剂包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)。

9.如权利要求1至4任意一项所述的一种检测硫酸软骨素二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的吡唑啉酮类衍生试剂包括PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP中的一种或任意几种联用。