[发明专利]一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用。

背景技术

在自然界的许多天然的转基因事件中，有一些事件在长期进化过程中被证明是安全的。其中，人类基因组最具有意义的是其19号染色体上有一个被称之为AAV病毒的整合位点AAVS1（adeno-associated virus integration site1）。自然情况下，AAV仅仅整合在AAVS1；在体外实验条件下，也有超过75%的AAVITR（inverted terminal repeat）附加的基因可以在rep蛋白指导下整合在AAVS1。

迄今为止，国内外的一系列研究成果都未发现任何已知人类疾病与AAV感染相关。此结论的重要性在于：该结论是以成年人大于90%的AAV感染率为前提得出的，具有高度可靠性，而AAV结构中的关键成分Rep蛋白和介导整合的顺式元件——位于AAV ITR或位于P5启动子内的核心元件16bp RBE（rep binding element），已经多次体内、外实验证实，可以构成可靠的定点整合转基因系统（Hum Gene Ther.2010;21(6):728-38.Gene Ther.2009;16(5):589-95.J Mol Biol.2006;358(1):38-45.）。

然而，单纯的含有此16bp RBE的定点整合转基因系统还存在着体外介导整合的效率尚可，体内介导整合的效率不高、基因表达产物的量有待进一步提高的缺点（Gene Ther.2009;16(5):589-95.）。而hAAT启动子和HCR（hepatic locus control region）元件可以增加以上定点整合转基因系统的体内表达效率（Mol Ther.2001;3(6):948-57.Mol Ther2000;1(6):522-32.J Surg Res.1994;56(6):510-17.）。因此，将定点整合系统所需核心元件和肝特异性调控元件（hAAT启动子、HCR元件）结合起来构建一个新的转基因表达系统，则可以在提供定点整合、保证安全的前提下提高转基因的表达效率。

发明内容

本发明描述了一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml的构建和应用。

本发明所述的pRBE-HCR-hAAT-hFIXml，序列如SEQ ID NO.17所示，其含有hAAT启动子、RBE元件和HCR调控元件。

所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml的构建方法，是将hAAT启动子和HCR调控元件插入去除了CMV启动子的pRBE-CMV-FIXml的位点Nhe I和Bgl Ⅱ之间得到pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。

构建方法具体包括以下步骤：

1）pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子载体获得

以pRBE-CMV-FIXml为模板，引物两端分别加入了酶切位点Bgl II、Nhe I，以这两引物扩增不含CMV启动子的质粒骨架；PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化；

2）hAAT片段扩增及pT-hAAT的构建

以人基因组DNA为模板，用含Nhe I的上游引物和含Bgl Ⅱ的下游引物扩增获得Nhe I-hAAT-Bgl ⅡDNA片段，将此片段用Nhe I和Bgl Ⅱ酶切后连接于T载体，得到pT-hAAT；

3）HCR片段扩增

以人基因组DNA为模板，用含Spe I的上游引物和含Spe I的下游引物扩增获得Spe I-HCR-Spe I DNA片段；

4）pT-HCR-hAAT构建

用Nhe I酶切T-hAAT，用DNA凝胶回收试剂盒纯化，与用Spe I酶切回收的HCR片段连接后，获得pT-HCR-hAAT；

5）HCR-hAAT片段的PCR扩增

以pT-HCR-hAAT为模板，用含Nhe I的上游引物和含Bgl Ⅱ的下游引物扩增获得Nhe I-HCR-hAAT-Bgl ⅡDNA片段；

6）pRBE-HCR-hAAT-hFIXml构建

“Nhe I-HCR-hAAT-Bgl Ⅱ”双链DNA片段进行Nhe Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切，通过DNA重组技术插入经Nhe Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切的pRBE-CMV-FIXml重组质粒，获得pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。