[发明专利]一种表达胸腺素β4的基因工程菌的制备及应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌的制备及应用方法，具体地，涉及一种表达胸腺素β4的基因工程菌的制备及应用方法。

背景技术

胸腺素β4（Thymosin beta 4，Tβ4）是由43个氨基酸组成的酸性多肽，N端第一个氨基酸Ser的氨基被乙酰化修饰，无二硫键。其氨基酸序列如下：Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。胸腺素β4 分子量为4964Da，等电点为5.1。

胸腺素β4是一种多功能因子，能够调节肌动蛋白的聚合、解聚，在促进皮肤创伤愈合、角膜损伤修复、神经损伤修复、抗炎症、促进组织再生、血管生成及抗细胞凋亡等方面起到重要作用。目前临床应用于皮肤创伤愈合、眼角膜损伤修复、干眼症治疗、心肌损伤修复、神经损伤修复以及化妆品领域（使皮肤年轻化、恢复皮肤的弹性、消除老年斑等）等。

目前有关胸腺素β4的产品还没上市，临床和研究用胸腺素β4主要来源于固相合成，这种化学合成方法需要大量的有机试剂，造成的严重环境污染。随着环境的日益污染，政府环评的逐年提高，化学合成方法将被逐步淘汰。此外，固相合成胸腺素β4成本也较高，杂质种类较多。因此，利用基因工程方法生产胸腺素β4势在必行。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于制备和使用能够表达胸腺素β4的基因工程菌的方法，通过基因工程方法制备多肽，特别是胸腺素β4，克服现有技术的不足，为今后低成本又环保地生产胸腺素β4奠定基础。

为了达到上述目的，本发明提供了一种表达胸腺素β4的基因工程菌的制备方法，其中，所述的制备方法包含：步骤1，合成能够在大肠杆菌内高效表达的胸腺素β4（Tβ4）基因序列；步骤2，将步骤1所得的基因重组进经虾碱性磷酸酶I（Sap I）酶切的pTWIN 1质粒载体，得到pTWIN-Tβ4融合载体；步骤3，以步骤2所得的pTWIN-Tβ4为模板，PCR扩增该载体上的内含肽序列以及Tβ4序列；步骤4，将步骤3所得的基因序列重组进经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切的质粒pET-28a中，得到pET-Tβ4表达载体；步骤5，将步骤4所得的pET-Tβ4转化至感受态大肠杆菌细胞BL21中，得到pET-Tβ4工程菌；步骤6，在pET-Tβ4工程菌菌液的OD₆₀₀值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导Tβ4表达。

本发明还提供了一种上述方法制备的表达胸腺素β4的基因工程菌的应用方法，其中，所述的应用方法包含以下步骤：步骤a，将制得的表达Tβ4的基因工程菌的菌液进行离心，收集菌体并经超声波破碎，再离心收集上清；步骤b，将所得的上清过镍柱纯化，得到Tβ4-内含肽的融合蛋白；步骤c，将纯化后的Tβ4-内含肽进行诱导切割，使其释放Tβ4，再通过液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）鉴定分子量。

本发明提供的表达胸腺素β4的基因工程菌的制备及应用方法具有以下优点：

1、成本低而且环保。由于胸腺素β4有43个氨基酸，用固相合成成本会比较高，而且环境污染严重。而大肠杆菌表达，氨基酸数量越多，根据化学计量法，质量也越大，产量就会越高，根据我们生产胸腺素α1的成本核算，发酵法生产胸腺素β4的成本比化学合成的低。

2、纯化工艺简单，只需一步亲和纯化，就可得到高纯度产物。

3、真正实现大肠杆菌表达N端乙酰化的胸腺素β4。

附图说明

图1为pTWIN-Tβ4工程菌菌落PCR鉴定结果示意图。

图2为pET-Tβ4工程菌菌落PCR鉴定结果示意图。

图3为SDS-PAGE鉴定结果示意图。

图4为液相色谱-质谱联用技术鉴定结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。