[发明专利]一种细胞内表达花生过敏原的重组乳酸乳球菌及其应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及细胞内表达花生过敏原Arah2的重组乳酸乳球菌菌株，其构建方法及应用，属于生物工程技术领域。

【背景技术】

花生过敏是最严重而且常见的食物过敏反应之一，具有发病快、致死率高及终生性等特点。近些年来，花生过敏的发病率在全球范围内有逐年上升的趋势。在美国，有1.1%的人口对花生过敏，其发病率在1997年至2002年间增长了近一倍。诱导特异性口服耐受，即在一段时间内通过给予患者逐渐增加剂量的过敏原以诱导患者对此种食物抗原产生免疫耐受的治疗方法，是目前比较有效的花生过敏治疗方法。

高纯度过敏原的获取是进行免疫耐受性诱导的前提和基础。花生过敏原共有11种，其中Arah2是一种分子量为17-19KDa的糖蛋白，可被超过90%的患者血清中IgE特异性识别，是目前研究最广泛也是最重要的花生过敏原之一。近些年来，分子生物学技术的发展使利用生物合成方法获取高纯度的过敏原成为可能。目前已有国内外研究者利用不同表达系统生产花生过敏原，如陶爱林等（2012）在专利《一种重组花生过敏原与突变体及其制备方法和应用》中介绍了利用大肠杆菌表达系统制备一种重组花生过敏原与突变体的方法；Katrin Lehmann等已成功利用大肠杆菌重组表达具有良好免疫原性的Arah2蛋白（Katrin Lehmann,et al.High-yield expression in Escherichia coli,purification,and characterization of properly folded major peanut allergen Arah2.Protein Expression and Purification,2003,31:250–259）。但大肠杆菌可产生结构复杂、种类繁多的内毒素，且表达产物的后续纯化成本高昂，限制了大肠杆菌原核表达系统的临床应用。

乳酸乳球菌长期以来被广泛应用于酸奶、奶酪、泡菜等传统食品的生产中，是公认安全的微生物。利用乳酸乳球菌表达外源蛋白可无需纯化连同菌体一起服用，同时利用乳酸乳球菌作为表达载体的黏膜疫苗可有效诱导机体产生免疫反应和免疫耐受。因此，我们利用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作为粘膜疫苗呈递载体，将花生过敏原Arah2在L.lactis细胞内进行表达，所构建的重组乳酸乳球菌菌株在医药工业等领域具有重大意义。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞内表达花生过敏原蛋白nArah2的重组乳酸乳球菌菌株及其构建方法，该菌株是用含有经过密码子优化的编码花生过敏原蛋白nArah2的编码基因的重组质粒pNZ1转化乳酸乳球菌所获得的，其中所使用的乳酸乳球菌可以是L.lactis NZ9000。转化后筛选所获得的菌株为L.lactis NZNH，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCC：8216。本发明还涉及所述重组乳酸乳球菌菌株的构建方法，所述方法包括如下步骤：

a)对花生过敏原Arah2的天然基因序列进行密码子优化以得到优化基因nArah2；b)利用优化基因nArah2进一步构建重组表达质粒；c)利用重组表达质粒转化乳酸乳球菌并筛选鉴定获取重组乳酸乳球菌菌株，其中所构建的重组表达质粒是胞内表达载体质粒PNZ1，构建重组表达质粒PNZ1时包括以质粒pUC57-nArah2为模板，利用引物Pra1F5'-CATGCCATGGGTCAACAATGGGAATTACAAG-3'和Pra1R：5'-CGGGGTACCTTAATAACGATCACGACCAC-3'对nArah2基因进行PCR扩增，步骤c）中的转化方法是电转化。

本发明还涉及包含所述的重组乳酸乳球菌菌株的疫苗，所述疫苗可以是口服制剂，例如胶囊剂、锭剂、粉剂或颗粒剂等。

本发明还涉及所述的重组质粒或重组乳酸乳球菌菌株在制备可用于治疗花生过敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。

本发明中重组花生过敏原蛋白nArah2成功地在L.lactis NZ9000细胞内进行表达，且动物实验结果表明，胞内表达方式的重组疫苗可以调节过敏性的系统免疫反应，逆转Th2型免疫应答向Th1型免疫应答转变。

因此，优化的花生过敏原nArah2基因可以重组质粒DNA疫苗的形式用于花生过敏的预防及治疗；重组乳酸乳球菌菌株可以胶囊、锭剂、粉包、颗粒状包装的形式，作为一种新型的口服疫苗应用于花生过敏的临床预防及免疫治疗。