[发明专利]知母中知母皂苷AⅢ在制备抗肿瘤药物的应用

说明书

技术领域

本发明属于药物学领域，涉及知母皂苷AⅢ在制备抗肿瘤药物中的应用，具体涉及知母皂苷AⅢ可通过死亡受体途径即Fas、FADD途径和内源性途径即线粒体、Cyto.c途径诱导A375-S2细胞凋亡与自噬，用于制备抗肿瘤药物。

背景技术

近年来,由于现代社会竞争加剧,生活压力增大,环境严重污染等因素,恶性肿瘤已成为危害人类生命健康的严重疾病之一，现已成为严重威胁人类健康的第二大“杀手疾病”！天然药物在癌症治疗中的作用备受关注，能否找到既能杀伤肿瘤细胞,毒副作用又比较小的药物及治疗方法,对肿瘤的临床治疗意义重大。

知母为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge）的干燥根茎。传统中药中常用于治疗肺病、发烧感冒、糖尿病、便秘等症。知母药材虽为单一品种，但分布较广，广泛分布于华北、东北、西北地区。经现代天然药物化学及药理学研究表明，知母中含有甾体皂苷、黄酮、木脂素、多糖、甾醇和脂肪油等，其中皂苷为其主要成分，以往及目前对知母的药理活性研究，基本都集中在抗衰老（知母宁）、抗抑郁（知母总皂苷）、治疗阿尔茨海默病（知母皂苷Q）、抗二型糖尿病（芒果苷）等领域，起到的基本都是保护细胞或促进细胞增殖的作用，但是在抗肿瘤、抗癌症方面的研究却少之又少。因此，本文对于充分利用知母植物资源具有重要意义！

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种从中药知母中提取分离的有效成分知母皂苷AⅢ在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是对黑色素瘤。所述的知母皂苷AⅢ具有如下结构：

其分子式为C₃₉H₆₄O₁₃，分子量为740.917660g/mol。

本发明采用MTT方法,在包括人肺癌细胞、人肝癌细胞、人结肠癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人黑色素瘤细胞、人淋巴瘤细胞等多种体外细胞毒活性模型上,检测知母中知母皂苷AⅢ的抗肿瘤活性,发现其具有广谱抗肿瘤活性，尤其对T475-S2细胞具有强且稳定的细胞毒性。其抗肿瘤活性的最小有效剂量为：10mg/kg.

本发明从细胞、分子水平探讨了知母皂苷AⅢ对T475-S2细胞的抗肿瘤作用机制。利用形态学、MDC荧光染色、AO/EB荧光染色、PI流式细胞术检测、Western Blot分析等方法详细研究了知母皂苷AⅢ对肿瘤细胞自噬与凋亡的影响，证明知母皂苷AⅢ可通过死亡受体途径即Fas、FADD途径和内源性途径即线粒体、Cyto.c途径诱导A375-S2细胞凋亡与自噬，进而使知母皂苷AⅢ在治疗肿瘤中发挥作用。

本发明优点:

知母皂苷AⅢ比5-Fu和紫杉醇杀伤A375-S2细胞能力更强，并且A3在6μM作用24h对hPBMC无明显细胞毒作用。初步确定A3具有选择杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无细胞毒作用。

通过活性筛选,确定此化合物具有明确的广谱抗肿瘤活性,并且说明了其抗肿瘤作用机制，可作为活性成份用于抗肿瘤药物的开发,为肿瘤的治疗提供了新的药物途径,从而扩大了临床用药的可选择范围,对充分利用知母植物资源具有重要意义！

附图说明

图1、MTT法测定知母皂苷AⅢ、5-氟尿嘧啶、紫杉醇对hPBMC的生长抑制作用。

图2、MTT法测定知母皂苷AⅢ、5-氟尿嘧啶、紫杉醇对T475-S2细胞的生长抑制作用。

图3、知母皂苷AⅢ对人恶性黑色素瘤T475-S2细胞有时间剂量依赖性的抑制作用。

图4、形态学观察知母皂苷AⅢ对人恶性黑色素瘤T475-S2细胞的杀伤作用。

图5、形态学观察知母皂苷AⅢ剂量依赖性缩小T475-S2细胞体积。

图6、PI染色流式细胞术检测SubG0/G1峰（凋亡峰）。

图7、吖啶橙/溴化乙啶荧光染色观察。

图8、丹磺酰戊二胺(MDC)荧光染色观察。

图9、罗丹明染色流式细胞术检测线粒体膜电位。

图10、免疫印迹法分析知母皂苷AⅢ作用于A375-S2细胞后procapase-8,procaspase-9,procaspase-3和caspase-3蛋白质表达情况。

A375-S2细胞用不同浓度的知母皂苷AⅢ2,4,6,8μM处理24h。细胞溶解物被用12%SDS-PAGE进行分离，蛋白质表达情况用免疫印迹法进行检测。

图11、浓度为1mM3-MA时抑制由知母皂苷AⅢ引起的A375-S2细胞自噬。