[发明专利]一种快速检测虾蟹螺原体胶体金免疫层析试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种虾蟹螺原体胶体金免疫层析检测试纸条及其制备和在虾蟹螺原体检测上的应用。

背景技术

中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris菌株保藏号CCTCC M207170^T=DSM21848^T)是一种新型虾蟹病原，不仅是河蟹“颤抖病”的致病菌，也是引起克氏原螯虾、南美白对虾和罗氏沼虾等水生甲壳动物重大疫病的致病菌，给养殖业带来巨大损失。目前虾蟹螺原体病原的检测可以利用光镜、电镜、PCR、ELISA、培养等检测技术，但这些技术（除ELISA外）都需要相关的仪器、设备和技术，无法在用于现场快速检测。而我们前期建立的ELISA快速检测技术，虽然可以用于生产实际的现场快速检测，但由于操作步骤较多，检测花费需要3h，操作者还需要进行培训。所以，需要研制一种更为简便、快速、廉价和适应性广的技术，有利于推广和应用。

胶体金免疫层析技术由于其快速、便捷，不需特殊设备，结果判断直观等优势，越来越受到人们的重视。迄今为止，还未见有虾蟹螺原体免疫胶体金试纸条方法建立的报道。胶体金免疫试纸条与其他诊断方法相比较，体现出以下特点：①快捷迅速，可在5～15min内显示结果；②灵敏准确，结果受外因影响较小，可在对虾养殖场现场进行检测；③操作简单，不需要任何特殊仪器和设备，尤其适合在基层推广应用；④成本低廉，所需样本和试剂量少；⑤保存和运输方便，一般保存于4℃冰箱，甚至可常温保存，而且保存期可以长达2年。本发明利用多克隆抗体和胶体金标记技术建立虾蟹螺原体胶体金免疫层析快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是以多克隆抗体为基础，通过免疫胶体金标记技术研制一种操作简单、成本低廉、快捷迅速的检测虾蟹螺原体的胶体金检测试纸条。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种快速检测虾蟹螺原体胶体金免疫层析试纸条，它包括样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸收垫、PVC板。其中，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次固定在PVC板上；其特征在于所述结合垫是无纺布结合垫，其中喷涂有免疫胶体金颗粒的抗虾蟹螺原体多克隆抗体，可与样品中的虾蟹螺原体发生抗原-抗体特异性结合；所述硝酸纤维素膜包括包被有抗虾蟹螺原体多克隆抗体的检测线和包被有羊抗兔IgG抗体的质控线。

一种上述试纸条的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)虾蟹螺原体多克隆抗体制备：采用经甲醛灭活后的螺原体全菌作为免疫抗原，经4次人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价螺原体多克隆抗体并进行纯化；

(2)纳米胶体金颗粒的制备：采用柠檬酸三钠作为还原剂制备40～50nm胶体金溶液，并调整胶体金溶液的pH至8，备用；

(3)制备抗虾蟹螺原体多克隆抗体的胶体金标记物：在电磁搅拌器下将抗虾蟹螺原体多克隆抗体缓慢加入备用的胶体金溶液中，虾蟹螺原体多克隆抗体的质量和胶体金溶液的体积比为0.015：1，经纯化和浓缩后形成胶体金标记的虾蟹螺原体多克隆抗体；

(4)结合垫的制备：结合垫上喷涂的胶体金标记的虾蟹多克隆抗体的浓度为15ug/ml，喷涂量为30ul/cm²；

(5)抗体固相硝酸纤维素膜的制备：将抗虾蟹螺原体多克隆抗体包被到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗体，浓度为1.2mg/ml，包被参数为1μl/cm；抗金标抗体的羊抗兔IgG二抗喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为质控线捕获抗体，浓度为1.2mg/ml，包被参数为1ul/cm；

(6)将吸收垫、带有检测线和质控线硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、PVC板组装成胶体金免疫层析检测试纸条。

其中，步骤⑴抗虾蟹螺原体多克隆抗体的制备：该多克隆抗体效价分别为1∶16384和1∶65536，用Protein A亲和层析柱纯化多克隆抗体，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定抗体浓度并调整为2mg/mL；

将依次粘好的底板材料切成裁切成宽×长为0.3cm×6cm的长条即为虾蟹螺原体胶体金免疫层析检测试纸条，包装备用。

用上述虾蟹螺原体胶体金免疫层析试纸条检测的方法，包括：如图2所示，若将含有虾蟹螺原体检测样品加入随机抽取组装的试纸条中，虾蟹螺原体与金标抗体结合并在层析作用下与T线抗体结合，室温下作用15min，阳性结果出现两条红线，即检测线T线和质控线C线，T线显示该样品中含有虾蟹螺原体；若检测样品中不含有虾蟹螺原体，阴性结果只在质控线C线出现一条红线，显示该样品中没有虾蟹螺原体。