[发明专利]生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因动物领域，具体而言，涉及生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法。

背景技术

随着细胞、组织和器官移植应用的增多，能够提供可供移植的细胞、组织和器官的动物和方法得到了广泛的关注和研究。其中，利用遗传工程获得转基因动物，尤其是能够表达荧光的转基因猪得到了广泛的研究，近年来，带有不同荧光基因的转基因猪不断被研制成功。

相关技术中，通过将荧光蛋白基因转入到猪体内，使转基因猪的全身表达荧光蛋白。使用该转基因猪的能够表达荧光的细胞、组织或器官进行移植时，可以根据荧光对移植后的细胞、组织或器官进行监视和追踪。

但是，相关技术中生产转基因猪的受体由于其基因序列与人类相近度低，因此，其细胞、组织或器官的移植应用受到了一定的限制。

发明内容

本发明的目的在于提供生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，用荧光蛋白表达载体转染五指山猪体细胞，生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪。

本发明实施例提供的生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，与现有技术中的转基因猪相比，其选用五指山猪，通过将荧光蛋白基因导入到其体内，生产全身能够表达荧光蛋白的转基因五指山猪。由于五指山猪的基因序列与人类相近度在90%以上，其血型类似人类O型血，血液生理生化指标、各组织脏器对药物的代谢等特征均与人类相似，则其细胞、组织或器官的移植得到了推广应用，广泛应用于药学、畜牧、兽医学，尤其应用于人类比较医学的各种试验中。尤其为人类器官移植的研究及各类动物模型培育、人源化猪器官移植开发应用研究提供了科学依据。

附图说明

图1示出了生产表达红色荧光蛋白的转基因五指山猪的方法流程；

图2示出了经G418筛选15d后得到的转基因细胞稳定表达的红色荧光；

图3示出了转基因细胞的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图4示出了重构卵细胞体外培养时的卵裂情况和囊胚胎发育情况。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

本发明实施例提供的生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，可以采用如下步骤进行操作：

步骤一，获得可转染的五指山猪体细胞。

五指山猪，主产于海南省五指山区，是中国著名的小型猪种之一。具有体型小、性成熟早、遗传稳定、适应性强等诸多特性，是一种非常适合进行实验的动物模型。

而且五指山猪的基因序列与人类相近在90%以上，其血型类似人类O型血，血液生理生化指标、各组织脏器对药物的代谢等特征均与人类相似。上述特性决定了五指山猪非常适合于人类细胞、组织或器官移植的研究，为人源化猪器官移植开发应用研究提供了资源。

本发明实施例提供的生产表达荧光蛋白的转基因五指山猪的方法，其中，可转染的五指山猪细胞可以选用五指山猪的耳皮细胞为体细胞，相对于胎儿细胞获得更加容易。

由于五指山猪耳成纤维细胞取材方便，操作简单，本发明实施例中，优选五指山猪的耳成纤维细胞。

参见图1，步骤二，用抗性荧光蛋白表达载体转染上述五指山猪体细胞。

荧光蛋白可以用来标记细胞，利用荧光蛋白标记细胞这种方法在监视移植细胞和组织上非常有效。用荧光蛋白标记的细胞进行移植后，可以对其进行监视和追踪，从而可以实时观察细胞的生长、转移、血管生成及药物疗效等。例如荧光蛋白标记的细胞在研究和治疗癌症中的应用。

按照本领域的常规方法，制备荧光蛋白的表达载体，并将抗性基因插入到上述荧光蛋白的表达载体中，形成抗性荧光蛋白表达载体，有利于后续在选择性培养基中进行阳性克隆的转基因体细胞的筛选操作。

用抗性荧光蛋白表达载体转染上述得到的五指山猪体细胞。转染操作之前，对可转染的五指山猪体细胞进行培养。

使用培养中的五指山猪体细胞进行转染实验，由于正在生长繁殖中的五指山猪体细胞处于活跃的状态，因此，其代谢活性强，进行转染时，载体进入细胞的速度以及与载体的结合速度等都比较快，有助于转染的进行。同时，在培养过程中，控制细胞生长的汇合度为75%～85%时，将其用PBS清洗1次后更换无血清培养基待用，从而进一步提高转染的速度以及成功的转染率。

本发明实施例中，转染的方法选自：FuGENE HD试剂转染，Lipofectamine TM2000试剂转染或Nucleofector TM转染。