[发明专利]一种来源于烟曲霉的植酸酶

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种来源于烟曲霉的植酸酶及其以应用。

背景技术

植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸水解酶（Myo-i-nositol hexaphosphate phosphohydrotase），是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸盐降解为无机磷和肌醇，同时释放出植酸盐结合的其他营养物质。可广泛用作饲料添加剂。目前，利用植酸酶饲喂单胃动物的效果已经得到了验证。饲料中添加植酸酶后，可以减少5-70%无机磷的用量，粪便中磷的排放量减少了30-40%以上，不仅大大降低了植酸盐的抗营养作用，增加生产效益，还能有效的降低环境污染，因此对植酸酶的研究具有重要的意义。

目前在天然材料中植酸酶的表达水平较低，酶学性能也不能满足饲料加工的应用，采用基因工程的手段，不仅可以提高植酸酶的酶活力，还能通过构建工程菌株改造酶的部分性质，使之更加适应工业化生产的条件。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种来源于烟曲霉的植酸酶，并通过将烟曲霉来源的植酸酶基因转化入里氏木霉中，构建了能高效表达该植酸酶的里氏木霉工程菌株。经木霉表达后，植酸酶的作用温度和pH都更适合作为饲料添加剂，从而有效提高养殖动物的生产性能，减少磷的排放量，降低环境污染。

本发明一方面提供了一种植酸酶，其特征在于：

（a）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶；

（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有植酸酶活性的酶。

用于编码上述植酸酶的基因，其中一种编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面涉及上述植酸酶在饲料中的应用。

有益效果

本发明提供了一种新型的植酸酶，并构建了重组表达该酶的里氏木霉工程菌株，摇瓶发酵酶活高达880U/mL。本发明制备得到的植酸酶可广泛应用于饲料中，能大大提高养殖动物各期平均日增重和料肉比，且使磷的排泄量降低了13.3%，从而有利于增加养殖效益，降低对环境的污染。

 

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

实施例1  烟曲霉植酸酶基因的克隆

以烟曲霉（Aspergillus fumigatus）基因组总DNA为模板，利用上下游引物进行扩增。

PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，进行测序分析。结果显示，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。经过NCBI Blast比对发现，该氨基酸序列与烟曲霉的植酸酶序列相似性为89%，为一新的等位基因。

实施例2 表达载体的构建

将实施例1中回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-TR质粒，然后用NcoI和KpnI进行双酶切，回收TR片段；取2μl回收产物与NcoI和KpnI双酶切pKDN-5载体连接过夜导入大肠杆菌DH5α，获得重组表达质粒pKDN-TR。

实施例3 转化与筛选

3.1原生质体制备