[发明专利]一种新的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的产N-乙酰神经氨酸大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，属生物工程技术领域。

背景技术

唾液酸是指一系列含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，系统命名为5-氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。唾液酸在自然界中分布广泛，已经发现许多生物体内都有唾液酸的存在，目前发现的唾液酸已有50余种，N-乙酰-D-神经氨酸（Neu5Ac)是唾液酸的主要种类，它的含量占整个唾液酸家族的99%以上，通常以α-糖苷的形式位于非还原性寡聚糖如糖蛋白和糖脂的末端。

近些年来，唾液酸已经越来越多的受到人们的关注，唾液酸已经成功在食品、医药和疾病诊断等领域得到应用，添加到婴儿奶粉中可以提高婴儿的智力和记忆力，提高其免疫能力。添加到饮料中可以预防感冒，增加肠道对维生素及矿物质的吸收。可以作为抗流感病毒药物合成的前体物质，对于肝病及肿瘤等的诊断具有重要价值。

从1964年Blix发现唾液酸至今，人们已经发现了多种唾液酸的生产方法，尤其是生产唾液酸中主成分N-乙酰神经氨酸的一些方法，包括天然原料提取法、化学合成法、酶催化法和发酵法等。其中天然原料提取法可得到高质量无污染的唾液酸产品，但由于天然原料中唾液酸含量极低，导致该方法唾液酸的生产成本居高不下，限制了其大面积推广应用。化学合成、酶催化在生产过程中需要添加昂贵的原料和有害的有机溶剂，导致其生产出来的唾液酸往往只能用于药物的合成，而无法应用于食品和保健品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的产N-乙酰神经氨酸基因工程菌及其构建方法和应用。本发明通过构建新的高产N-乙酰神经氨酸的基因工程大肠杆菌，提高了N-乙酰神经氨酸的产量。

为解决上述技术问题，本发明的产N-乙酰神经氨酸代谢工程菌，首先是通过引入并高表达6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因（AGE）和N-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），架构起从葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的合成通路，实现利用葡萄糖合成N-乙酰神经氨酸的目的。为了提高N-乙酰神经氨酸的产量，高表达了6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因（nagB）以提高前体物氨基葡萄糖的供应量。为进一步提高N-乙酰神经氨酸的产率，还可以敲除该代谢工程菌中的N-乙酰神经氨酸分解利用代谢途径酶的基因。在一个实施方案中，本发明的工程菌敲除乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶编码基因（nagA）以避免中间产物N-乙酰葡萄糖胺的分解；敲除N-乙酰神经氨酸分解代谢基因簇nanATEK，阻断N-乙酰神经氨酸的降解，达到在胞外积累终产物N-乙酰神经氨酸的目的。详见附图1。

所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.NM_001179949基因序列全基因合成，或利用酿酒酵母（如菌株S288C）的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因来源于鱼腥藻(Anabaena)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.DQ661858基因序列全基因合成，或利用鱼腥藻（如藻株Anabaena sp.CH1）的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述N-乙酰神经氨酸合成酶基因来源于空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.AF400048基因序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌（如菌株ATCC43438）的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物，6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因的获得可根据大肠杆菌W3110基因组GenBank No.NC_007779的中的nagB基因序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因（GNA1）、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因（AGE）、N-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB）和6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因（nagB）导入大肠杆菌并高表达，是将这四个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达。