[发明专利]犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条及制备方法

权利要求书

1.一种犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于：包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区、吸水区和底板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗体区和吸水区依次铺设在底板上并相互部分重叠；金标探针区包被有胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体F1；固相化抗体区依次有检测线和对照线，检测线包被有抗犬细小病毒单克隆抗体B6；对照线包被有羊抗小鼠IgG；所述的抗犬细小病毒单克隆抗体F1和B6由抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株F1和B6产生，抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株F1和B6保藏编号分别为CCTCC NO：C2013175和CCTCC NO：C2013176。

2.根据权利要求1所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述的胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体F1的标记量为1～10μg/mL；所述的抗犬细小病毒单克隆抗体B6的包被量为0.1～10μg/cm；所述的羊抗小鼠IgG的为0.1～10μg/cm。

3.根据权利要求1所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述的底板的材料为聚乙烯板；所述的样品吸收区的材料为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料为聚酯膜；所述的固相化抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸。

4.权利要求1-3任一项所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体F1喷涂于聚酯膜上；在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和对照线；将玻璃纤维膜、包被有抗犬细小病毒单克隆抗体F1的聚酯膜、包被有检测线和对照线的硝酸纤维素膜、和吸水滤纸组装到聚乙烯板上得到犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条。

5.根据权利要求4所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）抗犬细小病毒单克隆抗体的制备：选8～10周龄体重20g以上的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔分别注射抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株F1和B6，接种量为2×10⁶～4×10⁶细胞/0.5mL/只，经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000rpm离心15min，取上清备用；将腹水用50%饱和度的硫酸铵盐析2次，透析除盐即得纯化的抗犬细小病毒单克隆抗体F1和抗犬细小病毒单克隆抗体B6；

（2）胶体金标记抗犬细小病毒单克隆抗体F1的方法：分别取半径为5～40nm的胶体金20mL及抗犬细小病毒单克隆抗体F1 50～200μg，在pH 8.0～9.0的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加PEG-20000作为稳定剂，且使得PEG-20000最终质量浓度为10～20%，采用离心法除去未结合的抗犬细小病毒单克隆抗体F1和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金-F1复合物；

（3）将胶体金-F1复合物喷涂于聚酯膜上：用20mL聚乙二醇洗涤胶体金-F1复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL浓度为2mmol/L、pH 6.0～8.0的硼酸缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上15μL/cm，冻干；

（4）硝酸纤维素膜的包被：检测线包被的是抗犬细小病毒单克隆抗体B6，包被量为0.1～10μg/cm，对照线包被的是羊抗小鼠IgG，包被量为0.1～10μg/cm，每条线宽2～5mm；

（5）试纸条制备：将玻璃纤维膜、包被胶体金-F1复合物的聚酯膜、包被检测线和对照线的硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次粘附于聚乙烯板上，将组装好的试纸条纵向切成4mm的条状即为犬细小病毒胶体金免疫层析试纸条。

6.权利要求1-3任一项所述的犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条的使用方法，其特征在于包括如下步骤：检测时，用无菌棉签沾取待检动物的粪便样品，在PBS缓冲液中混匀，待大颗粒沉于管底后，取上清滴在该试纸条样品吸收区，5～10分钟后判读结果，对比检测线和对照线的颜色，即可判定被检动物体内是否带有犬细小病毒或感染犬细小病毒。