[发明专利]一种高产雷帕霉素发酵工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中利用微生物发酵生产抗生素的方法，具体说是一种高产雷帕霉素发酵工艺。

背景技术

雷帕霉素（Rapamycin , RAPA )，又名西罗莫司（Sirolimus )，分子结构如图1 RAPA 的分子式为C₅₁H₇₉NO₁₃，分子量 99lKD ，为白色固体结晶，熔点为 183 ～185 ℃ ，比旋光度[ɑ]²⁵_D=153⁰（甲醇），亲脂性，溶解于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，极微溶于水，几乎不溶于乙醚，在血浆中pH呈低中性，在37℃降解特别快，在血浆中半衰期为1～5h。雷帕霉素是由三十六元环组成的含氮三烯大环内酯类新型免疫抑制剂，它具有抗真菌、抗增殖和抗肿瘤作用，近年来雷帕霉素被成功应用于临床，作为治疗器官移植排斥药物，是肾毒性最低的免疫抑制剂。

一般认为，雷帕霉素与FKBP12结合，RAPA-FKBP12复合物与哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)结合，但它不阻断T细胞生长因子的生成，而是阻断这些因子提供的增生信号，抑制多种刺激引起的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增生，使细胞停留在细胞周期Gl期晚期，阻止这些细胞进入S期。

雷帕霉素制剂逐渐应用于临床：（1）用于防治肝肾器官移植的排斥反应。（2）具有抗真菌活性，特别是抗白色念珠菌。（3）具有抗肿瘤特性。（4）用于预防或治疗系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、血管损伤引起的平滑肌细胞增生和内膜细胞增生。（5）涂在支架上用于预防冠状动脉再狭窄的治疗。

现在，雷帕霉素衍生物也逐渐应用于临床，2007年FDA批准西罗莫司酯化物（Temsirolimus）上市，用于晚期肾细胞癌的治疗，依维莫司（Everolimus）于2009年应用于临床，二甲基亚膦酰雷帕霉素对纤维肉瘤、胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌和子宫内膜瘤等多种人体肿瘤细胞有抑制作用。

雷帕霉素具有广泛的临床应用前景，但目前主要采用发酵法生产雷帕霉素，一般雷帕霉素产生菌采用吸水链霉菌（Streptomyces hygrocscopicus NRRL5491），发酵单位为150到400ug/ml。CN102433364公开了一种采用发酵法生产雷帕霉素工艺，采用的菌株为CGMCC No.5145，是以NRRL5491为出发菌株经过紫外诱变原生质体的方法筛选获得的，并对培养基进行优化，在100L发酵罐中最高可获得815mg/L的雷帕霉素。

专利CN102229968公开了在7L发酵罐中发酵生产雷帕霉素，采用优化的培养基：甘油、葡萄糖、黄豆饼粉、酵母抽提物、蛋白胨、赖氨酸、无机盐。发酵前期采用流加葡萄糖，后期控制流加莽草酸和赖氨酸前体，雷帕霉素最高产量可达700mg/L。

专利CN101486976公开了采用吸水链霉菌（编号为CCTCC NO:207200）进行发酵，雷帕霉素最高产量可达600mg/L。李进（硕士论文 2012）研究优化了发酵生产雷帕霉素工艺，综合考虑氨基酸、前体及辅助因子等因素，当培养204h时，效价可达到860.6ug/ml。

从以上专利文献中，可以得到雷帕霉素发酵单位达到600mg/L以上，但存在以下几方面问题：培养基不合理，粘度高，导致在大规模发酵过程中溶解氧含量低，不利于菌体生长；发酵过程中不补料，菌体密度低；发酵中后期补料不合理，不利于雷帕霉素的生物合成，导致雷帕霉素含量低；在发酵过程中没有对中间代谢产物进行控制，发酵过程中间副产物过多，杂质含量高，雷帕霉素效价低，导致提取成本过高。

发明内容

本发明旨在提供一种在生成期减少去甲基衍生物，增加雷帕霉素含量；减少中间产物，保持雷帕霉素生成关键酶活性；从而提高雷帕霉素产量的一种高产雷帕霉素发酵工艺。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高产雷帕霉素发酵工艺，采用吸水链霉菌发酵法制取雷帕霉素，作为本发明的技术特征，所用方法分为以下几个步骤：

①将菌种转接种于斜面培养基上，于28℃的生化培养箱中培养10～15天，待斜面完全被孢子覆盖，孢子颜色由白转浅灰色后，即刻使用或贮存于4℃的环境下；

②用接种铲从己培养好的雷帕霉素产生菌斜面上取一环(或按0.5%孢子悬液量)接种至装有30m/250ml种子培养基的锥形瓶中，摇床转速为200r/m，温度为30℃，培养52～60h。