[发明专利]一种Small RNA cDNA文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种Small RNA cDNA文库的构建方法。 

背景技术

生物技术和生命科学将成为21世纪引发新科技革命的重要推动力量，包括我国在内的诸多国家已将其列入优先发展的重点研究领域，而基因测序技术作为生物产业发展的核心共性技术，已成为各发达国家竞相抢占的科技制高点，而相关的技术均被少数几家欧美公司所垄断且设备价格昂贵。 

基因测序要用基因测序仪和测序试剂，而基因测序仪和试剂盒的生产因为涉及有机化学合成，基因改造，催化酶合成和测序等多方面的技术，工艺复杂，质量要求高，目前主要只有三个美国生产厂家，而一台仪器一年的试剂费用达1000多万元。因为消耗高，我国很多高价购置的测序仪都处于闲置和瘫痪状态。 

基因测序工作仍然与我们密切相关,因为蛋白质组仅能告诉我们疾病的分子症状,而基因才是引发疾病的根本原因。若要进行疾病预测,疾病敏感基因的鉴定就必不可少。只有综合运用遗传学,蛋白组学,转录组学和代谢组学才能推动个体化医疗前进。 

高通量测序技术，是近几年出现的一项革命性测序技术,利用其高通量高覆盖度的优势,可以在极短的时间内获取数百万甚至数十亿的序列数据信息。目前在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。 

科学往往是在技术的竞争中发展进步的,高通量测序技术的发展亦是如此,随着第三代测序技术的发展,个体化医疗等诸多生命科学与医学问题的解决很大程度上依托测序技术的发展，应用前景非常广阔，市场非常巨大。 

发明内容

本发明的目的是提供一种Small RNA（microRNAs、siRNAs和piRNAs）cDNA文库的构建方法。 

本发明提供的一组DNA分子，该组分子由如下（1）-（4）所示的四种分子组成： 

（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子； 

（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子； 

（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子； 

（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。 

一组3’接头分子也属于本发明的保护范围，该组分子是将上述DNA分子的5’末 端连接一个rApp，3’末端连接一个封闭基团制成； 

所述封闭基团具体为氨基、2',3'-双脱氧胞嘧啶核苷或3’倒置的脱氧腺嘌呤核苷。 

一组反转录引物也属于本发明的保护范围，该组引物由如下（1）-（4）所示的四种分子组成： 

（1）SEQ ID No.5所示的DNA分子； 

（2）SEQ ID No.6所示的DNA分子； 

（3）SEQ ID No.7所示的DNA分子； 

（4）SEQ ID No.8所示的DNA分子。 

5’接头分子也属于本发明的保护范围，该分子的序列如SEQ ID No.9所示。 

上述5’接头分子中，所述分子的碱基全部进行2’甲氧基修饰或硫代修饰。 

一对引物也属于本发明的保护范围，该对引物由如下（1）和（2）所示的两种分子组成： 

（1）SEQ ID No.11所示的DNA分子； 

SEQ ID No.11所示的DNA分子中的5’-GTCTCCGACTCAG-3’序列与上述任一所述的5’接头分子的部分序列一致； 

（2）SEQ ID No.12所示的DNA分子； 

SEQ ID No.12所示的DNA分子中的5’-TCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’序列与上述一组DNA分子或上述3’接头分子的部分序列互补。 

一种构建Small RNA cDNA文库的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述DNA分子或上述3’接头分子、上述反转录引物、上述任一所述的5’接头分子和所述的引物组成。 

上述试剂盒中，所述试剂盒还包含RNA连接酶反应缓冲液、DMSO或PEG、不含核酸酶的水、截短型T₄RNA连接酶2、RNA酶抑制剂、第一链反应缓冲液、dNTPs、二硫苏糖醇、反转录酶、ATP、T₄RNA连接酶1、高保真PCR扩增缓冲液、dNTPs和高保真DNA聚合酶。 

一种分离Small RNA的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤： 

（一）提取总RNA； 

（二）将总RNA转移至超滤柱中，12000rpm离心15min，得滤液；