[发明专利]一种Small RNA cDNA文库的构建方法

权利要求书

1.一组DNA分子，该组分子由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：

（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；

（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。

2.一组3’接头分子，该组分子是将权利要求1所述的DNA分子的5’末端连接一个rApp，3’末端连接一个封闭基团制成；

所述封闭基团具体为氨基、2',3'-双脱氧胞嘧啶核苷或3’倒置的脱氧腺嘌呤核苷。

3.一组反转录引物，该组引物由如下（1）-（4）所示的四种分子组成：

（1）SEQ ID No.5所示的DNA分子；

（2）SEQ ID No.6所示的DNA分子；

（3）SEQ ID No.7所示的DNA分子；

（4）SEQ ID No.8所示的DNA分子。

4.5’接头分子，该分子的序列如SEQ ID No.9所示。

5.根据权利要求4所述的5’接头分子，其特征在于：所述5’接头分子的序列中的碱基全部进行2’甲氧基修饰或硫代修饰。

6.一对引物，该对引物由如下（1）和（2）所示的两种分子组成：

（1）SEQ ID No.11所示的DNA分子；

SEQ ID No.11所示的DNA分子中的5’-GTCTCCGACTCAG-3’序列与权利要求4或5所述的5’接头分子的部分序列一致；

（2）SEQ ID No.12所示的DNA分子；

SEQ ID No.12所示的DNA分子中的5’-TCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’序列与权利要求1或2所述分子的部分序列互补。

7.一种构建Small RNA cDNA文库的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的3’接头分子、权利要求3所述的反转录引物、权利要求4或5所述的5’接头分子和权利要求6所述的引物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含RNA连接酶反应缓冲液、DMSO或PEG、不含核酸酶的水、截短型T₄RNA连接酶2、RNA酶抑制剂、第一链反应缓冲液、dNTPs、二硫苏糖醇、反转录酶、ATP、T₄RNA连接酶1、高保真PCR扩增缓冲液、dNTPs和高保真DNA聚合酶。

9.一种分离Small RNA的方法，包括如下步骤：

（一）提取总RNA；

（二）将总RNA转移至超滤柱中，12000rpm离心15min，得滤液；

（三）转移滤液至管中，加滤液1/10体积的3M NaAc和3倍体积无水乙醇，-20℃冻存30min；

（四）4℃12000rpm离心30min，去上清，得沉淀；

（五）在沉淀中加体积百分含量为80%的乙醇水溶液，4℃12000rpm离心5min，去上清，风干得沉淀；

（六）重复步骤（五）一次，得沉淀，即为Small RNA。

10.一种构建Small RNA cDNA文库的方法，包括如下步骤：

（一）从样品中分离Small RNA；

（二）在Small RNA分子的3’末端连接权利要求2所述的3’接头分子；

（三）将步骤（二）得到的分子与权利要求3所述的反转录引物退火，得到退火产物；退火产物中的反转录引物与所述3’接头分子互补成双链结构；

（四）将退火产物进行cDNA第一链的合成；

（五）在步骤（四）的产物的5’末端连接权利要求4或5所述的5’接头分子；

（六）以步骤（五）的产物为模板，以权利要求6所述的引物为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（七）回收PCR扩增产物中长度为100±10bp条带，进行纯化，得Small RNA cDNA文库；

所述步骤（一）中分离Small RNA的方法具体为权利要求9所述的方法；

和/或，

权利要求1所述的DNA分子、权利要求2所述的3’接头分子、权利要求3所述的反转录引物、权利要求4或5所述的5’接头分子和/或权利要求6所述的引物在构建Small RNA cDNA文库中的应用；

和/或，

权利要求7或8所述的试剂盒在构建Small RNA cDNA文库中的应用。