[发明专利]一种分离提纯多抗菌素的方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种分离提纯多抗菌素的方法，属于生物工程领域，具体涉及发酵产物的提取、分离纯化的方法。

背景技术

多抗菌素（Polyoxins）也被称为多抗菌素、多抗霉素、多氧霉素，是一种肽嘧啶核苷酸类的农用抗生素，研究表明，多抗菌素由至少14种（Polyoxins A-N）单体结构组成。从链霉菌发酵产生的多抗菌素主要是多抗菌素A和多抗菌素B两种成分，其中多抗菌素B活性远大于多抗菌素A，起主要抗菌作用。多抗菌素B熔点大约在160℃左右；常温下易溶于水，不溶于有机溶剂；在pH2.5～3.0的酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定，对紫外光稳定。

多抗菌素各种单体结构都由一个核苷结构和一个多肽结构通过肽键连接起来，由于该结构与几丁质合成酶的底物脲二磷-N-乙酰氨基葡萄糖结构相类似，因此对几丁质合成酶有强效的竞争性抑制作用，从而产生对灰霉病、霜霉病、早疫病、叶霜病、白粉病、枯萎病等多种真菌性植物病害的防治作用，是一种广谱性抗生素类杀菌剂，具有较好的内吸性。其主要特点是：菌种资源多，制剂剂型多，作用对象多，无毒，无刺激，无残留。

自从日本理化研究所为首的科研机构开发，并于1967年获得农用抗生素登记以来，多抗菌素为日本Kaken制药株式会社所垄断，虽然国内也有厂家研发和生产，但无论从产品质量上，还是发酵产量上，都远达不到国外水品，甚至不能满足国内市场的需求，而进口国外的同类产品成本过高，导致这种高效的广谱农用抗生素迟迟不能在国内大规模推广应用。目前，国内对于多抗菌素的研究主要集中在发酵调控以及检测分析方法上，对于从发酵液中分离提取多抗菌素的报道较少。因此，开发一种新型的操作程序简单，设备要求低，收率高的多抗菌素提取方法是迫在眉睫的。

发明内容

本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供一种分离提纯多抗菌素的方法，采用三氯乙酸沉淀法结合多次有机溶剂清洗、离心纯化从发酵液中提取高纯度的多抗菌素，操作程序简单，设备要求低，收率高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种分离提纯多抗菌素的方法，其具体步骤如下：

（1）取链霉菌发酵液，用纱布过滤，发酵液过滤后继续用冰水清洗纱布，收集滤过液，向滤过液中加入脱氧胆酸钠溶液，静置10～20min；

（2）将步骤（1）所得的滤过液进行离心，收集上清液；

（3）将步骤（2）所得的上清液体转移到容器中，加入三氯乙酸溶液，将容器密封后，0～4℃下静置8～16h；

（4）将步骤（3）得到的溶液离心，弃上清液，用有机溶剂冲洗沉淀后移入超滤管内；

（5）向步骤（4）的超滤管内加4～6倍体积步骤（4）中的有机溶剂，稀释；

（6）将步骤（5）得到的液体离心后，继续添加有机溶剂稀释到步骤（5）中稀释后溶液的体积数；

（7）重复步骤（6）3～5次，最终离心浓缩至步骤（5）稀释后溶液体积的1/8～1/12；

（8）将步骤（7）所得的浓缩液体转移出，用冻干机冻干后，得到的粉状物即为多抗菌素。

优选步骤（1）中所述的纱布为80～120目，层数为3-6层，所述的清洗用的冰水与发酵液体积比为0.15～0.20:1；所述的冰水温度为0～4℃。优选步骤（1）中所述的脱氧胆酸钠溶液的浓度为0.015～0.025g/mL；添加的脱氧胆酸钠溶液与最初链霉菌发酵液体积比为0.008～0.012:1。

优选步骤（2）和（4）中所述的离心转速为8000～10000rpm，离心时间为20～30min，离心温度为2～6℃。

优选步骤（3）中所述的三氯乙酸溶液的浓度为0.8～1.2g/mL，添加的溶液与最初链霉菌发酵液体积比为0.10～0.15:1。

优选步骤（4）中所述的用于清洗的有机溶剂与步骤（1）中最初链霉菌发酵液的体积比为0.01～0.02：1。

优选步骤（4）、（5）和（6）中所述的有机溶剂均为甲醇、乙醇或丙酮。

优选步骤（5）中所述的超滤管的滤膜截留分子量为1～3kDa。

优选步骤（6）中所述的离心转速为4000～5000rpm，离心时间为30～40min，离心温度为2～6℃。

本发明采用的链霉菌其分类命名为金色产色链霉菌，参据的微生物（株）为：NJYHWG66382，该菌株是本课题组自主筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所）。其简称为CGMCC，保藏日期是2012年2月14日，登记入册的编号是CGMCCNo.5756。