[发明专利]抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，确切地说是抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及应用。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli， EHEC)主要包括O157:H7， O26:H11和O111等几种血清型，其中O157:H7是典型菌株。O157:H7感染能引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis，HC)、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症，在儿童和老年人中还可引起溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癫等严重并发症，重者可引起死亡。O157: H7 引起的肠道感染性疾病已成为一个严重的全球性公共卫生问题，在许多国家导致多起爆发流行。O157: H7 可引起出血性肠炎，约有10%的患者发展为溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癜, 死亡率高达30%以上。世界卫生组织(WHO) 已把EHEC O157: H7 出血性肠炎列为新发传染病。EHEC 0157:H7感染已成为全球性的公共卫生和食品安全问题，对其进行快速、特异的检测对于该病的早期诊断及疫情有效控制至关重要。

目前检测EHEC O157: H7常规采用山梨醇-麦康凯琼脂( SMAC) 培养基，选择山梨醇发酵阴性的大肠杆菌，进一步用生化和血清学试验做鉴定，需要24～48 h。采用PCR方法进行检测需要较昂贵的仪器，费用高，不易于基层单位推广。单克隆抗体因具有良好的特异性、稳定性和可重复性等优点，但是可靠的EHEC O157: H7的单克隆抗体杂交瘤不容易制备，目前我国一直靠进口。

发明内容

本发明的目的是一株抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤及其分泌的抗体和应用。

抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，它的保藏编号为：CGMCC No.6251；

抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，它是由上述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的；

一种液相芯片检测株大肠杆菌O157:H7的试剂盒，它的检测抗体为上述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体；

一种胶体金检测大肠杆菌O157:H7的试纸条，它的检测抗体为上述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体。

本发明提供了抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的该菌单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于液相芯片和胶体金法检测食品中大肠杆菌O157:H7，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。

附图说明

图1. 融合12天后倒置显微镜观察结果；

图2. 大肠杆菌O157:H7单克隆抗体ProtienG柱纯化结果；

图3. 单克隆抗体亚型测定结果；

图4. BCA法测定单抗蛋白含量标准曲线；

图5. 非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力；

图6. 捕获抗体最佳工作浓度的确定；

图7. 灵敏度检测结果；

图8. 特异性检测结果；

图9特异性检测结果；

图10胶体金试纸条的组装顺序。

具体实施方式：

实施例1大肠杆菌O157:H7抗原菌液的制备和BALB/c小鼠免疫

取本研究实-80℃保存的标准大肠杆菌O157:H7（ATCC11229），经肉汤培养后，划线法于LB上培养，常规方法增菌培养，6000r/min离心10min，收集菌体沉淀，用灭菌生理盐水重复离洗三次后进行菌落计数（2.0×10⁸CFU/mL），加入终浓度为0.3%的甲醛4℃过夜使菌体灭活。次日将洗脱好的菌液在20KHz、150W的冰浴条件下进行超声波使菌体细胞破碎，每次破碎10s，间隔10s，总用时20min。采用BCA蛋白测定试剂盒测定菌体蛋白含量，结果为2.636 mg/mL。

取8周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。首免采用上述灭活菌液（2×10⁸CFU/mL）与等量弗氏完全佐剂混合后腹腔注射50μL，皮下注射50μL，以后每隔2周免疫1次，换用弗氏不完全佐剂，剂量同前，共免3次。

实施例2免疫小鼠血清抗体效价的测定