[发明专利]一种基于磁珠快速检测PP65的方法

说明书

技术领域

本发明涉及人巨细胞病毒的检测方法，尤其涉及一种基于磁珠快速检测PP65的方法，属于分子生物学领域。 

背景技术

人巨细胞病毒(hμMan cytomegalovirus，HCMV)属于疱疹病毒科乙组疱疹亚科，是一种双螺旋DNA病毒。HCMV呈世界性分布，在人群中广泛传播，病毒长期潜伏于宿主细胞，呈隐性感染。当妊娠，易造成胎儿宫内感染，导致流产、早产、死胎或胎儿先天畸形；当骨髓移植，肝、肾、心脏等器官移植患者免疫功能受损时，潜伏病毒被激活、增值而发生严重感染，将导致患者器官移植失败甚至死亡。近年来，有研究表明巨细胞病毒感染与一些炎症性疾病和增殖性疾病有着密切的关系，包括某些心血管疾病和癌症。现今，巨细胞病毒感染已对人类健康造成极大的威胁，故对HCMV感染的早期诊断显得尤为重要。研究表明，一旦出现HCMV感染的临床症状，抗病毒药物不能控制该病的病理进程，这意味着抗病毒药物必须在HCMV感染的临床症状出现前就使用，这就有赖于实验室的分析。 

在HCMV实验检测技术中，病毒分离是检测的金标准，但耗时长，结果受标本保存时间影响大。抗体检测需在患者感染一定时间后才可以检出，受患者自身免疫状态影响较大，且不能区分潜伏感染和活动性感染。抗原血症检测技术是一项快速、敏感的诊断技术，但是传统检测方法多以白细胞为病毒抗原检 测载体，限制了其临床应用。而核酸诊断其敏感性与特异性均佳，但检测费用高且核酸提取方法还有待改进。 

PP65是HCMV病毒复制的早期蛋白，它出现于病毒感染的早期，在细胞感染后3-4小时即开始出现，是HCMV病毒含量最丰富的蛋白。其功能是将病毒的DNA锚定在受感染细胞的核膜上，在胞浆的高尔基体内合成，然后运回核内。随着研究的深入，HCMV-PP65抗原被认为是HCMV感染表达的早期抗原，PP65抗原分析能敏感地在早期预测HCMV病。HCMV常规病毒培养（CCC）往往需要4周才能获阳性结果，对早期诊断帮助不大。HCMV特异性抗体IgM，在严重免疫抑制患者可不出现或延迟出现。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于磁珠快速检测PP65的方法。 

本发明的技术方案如下：一种基于磁珠快速检测PP65的方法，包括以下步骤： 

（1）在离心管中加入0.5～1μL的羧基修饰磁珠，MES清洗三次，加入80～100μL0.5g/L的EDC，37℃活化2～4小时； 

（2）直接加入2～5μM HEX红色荧光标记的与人巨细胞病毒PP65抗原具有特异性的适配子，室温轻轻震荡孵育4～6小时，磁分离后弃上清，Washing buffer清洗三次；所述适配子为SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的序列之一； 

（3）用0.1～0.3%的BSA80～120μL37℃封闭过夜，Washing buffer清洗三次； 

（4）磁分离后弃上清，加入待检样品，室温轻轻震荡孵育10～14小时； 

（5）磁分离后弃上清，Washing buffer清洗三次，加入8～12ng的用Binding buffer配置的FITC绿色荧光标记的PP65单克隆抗体，室温孵育6～10小时； 

（6）磁分离后弃上清，Washing buffer清洗三次，加入30～70μL的Binding buffer，荧光显微镜下观察；如果待检样品中有PP65抗原，则在显微镜下既能看到红色荧光又能看到绿色荧光；如果待检样品中没有PP65抗原，则在显微镜下只能看到红色荧光，不能看到绿色荧光。 

所述步骤（2）中的适配子SEQ ID No.1～SEQ ID No.6的二级构象依次分别为： 

所述Binding buffer为：PBS,5mM MgCl₂,0.05%tween-20,pH7.5。 

所述Washing buffer为：PBS,5mM MgCl₂,0.01%tween-20,pH7.5。