[发明专利]一种产5‑酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5‑酮基米尔贝霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，尤其涉及一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法。

背景技术

米尔贝霉素是一种大环内酯类驱虫药物，日本三共株式会社于1967年发现，经过多年的改良于1986年正式以商品名米尔贝肟（milbemycin oxime）上市。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的肟衍生物，米尔贝肟对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD₅₀是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。

目前，米尔贝肟是通过半合成的方法生产。首先，产米尔贝霉素的链霉菌经过发酵，从发酵产物中提取得到米尔贝霉素A3和A4。然后米尔贝霉素A3或A4的C-5羟基被氧化成酮。这种5-酮基米尔贝霉素与盐酸羟胺在二噁烷-甲醇-水中发生反应，得到米尔贝肟。

其中，米贝尔霉素A3具有式I所示结构，米贝尔霉素A4具有式II所示结构，5-酮基米尔贝霉素A3的结构如式III所示，5-酮基米尔贝霉素A4的结构如式IV所示。

所述产米尔贝霉素A3和/或A4的链霉菌主要有链霉菌（Streptomyces milbemycinicus）和冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)，冰城链霉菌如(Streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734（亦称Streptomyces bingchenggensis BCW-1）内有基因（GenBank:FJ560599.2），在大肠杆菌中进行表达后的体外实验证明，该基因的表达产物可以将5-酮米尔贝霉素A3和/或A4对应转化为米尔贝霉素A3和/或A4，本发明将milF基因定义为泛指：来自于链霉菌、序列与GenBank FJ560599.2高度类似或相同、具有“将5-酮米尔贝霉素A3和/或A4对应转化为米尔贝霉素A3和/或A4”功能的基因；Streptomyces milbemycinicus，如本发明的链霉菌HS023亦有milF基因（经本发明人测序，序列如SEQ ID NO:2所示，基本与GenBank FJ560599.2同）。显然，能直接产5-酮基米尔贝霉素的菌株，将缩短米尔贝肟的生产工艺，但目前尚未有直接生产5-酮基米尔贝霉素的菌株的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法，本发明采用基因工程的方法，敲除链霉菌中的milF基因，阻止链霉菌代谢产生的5-酮基米尔贝霉素被milF氧化为米尔贝霉素，从而使其能够产5-酮基米尔贝霉素。

本发明提供了一种用于敲除产米尔贝霉素A3和/或米尔贝霉素A4的原始链霉菌milF基因的基因敲除质粒，其包含milF基因同源片段，该片段缺失了SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸，本发明的“缺失”是指该片段与SEQ ID NO:2相比包含这样的同源序列：该同源序列不含所述SEQ ID NO:2的105～767个核苷酸序列，而SEQ ID NO:2的其他序列均出现在该同源序列中。缺失的片段可为连续的也可为不连续的，本发明对此不做限定，其皆在本发明的保护范围之内。

作为优选，本发明提供的用于敲除链霉菌milF基因的基因敲除质粒，包含抗性标记基因，还包含顺序连接的以下核苷酸片段：上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段；

其中，所述上游核苷酸片段为如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第n～2467个核苷酸，1≤n≤2178，n为整数；

所述milF基因同源片段为在如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间缺失105～767个核苷酸的序列；

所述下游核苷酸片段为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第1～m个核苷酸，997≤m≤3108，m为整数。