[发明专利]一种RNA表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种RNA表达载体及其用途。

发明背景    nodaviruses单股正链RNA基因组的二十面体病毒。昆虫和鱼幼虫已分离出几种不同的病毒家族成员，然而，尽管病毒的自然宿主范围有限，许多诺达病毒RNA复制酶保留完整的昆虫，哺乳动物，植物，甚至是酵母细胞的活性，它们之间的最简单和最强大的真核生物RNA复制酶称为。诺达病毒RNA复制酶的复制产生大量皑皑的mRNA在细胞质，例如，放大后nodamura病毒（11）的RNA在幼仓鼠肾细胞（BHK21）24小时，正链RNA的复制产品之丰富的核糖体（约有10.sup.7每个细胞的分子）和主宰细胞的蛋白质合成能力。

分子生物学的Nodaviridae，病毒颗粒含有一个分子中的两个单链的基因组片段，基因组RNA1和RNA2，这两者都是需要的病毒感染。这些RNA的5'帽，但没有3'聚腺苷酸尾。相反，其3'末端被封锁由一个共价修饰或不寻常的二级结构。 RNA1，在良好的特点羊群房子病毒（FHV），含有3107个核苷酸，编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA复制酶），同时复制RNA1和RNA2基因组片段的整个病毒的贡献。 RNA1因此可以独立复制RNA2构成一个自主RNA复制子（3）。其核苷酸序列显示预测112千道尔顿（kDa）的多肽的开放阅读框（ORF）（蛋白A），对应的RNA复制酶的催化亚基。在复制过程中基因组RNA1，一个子基因组RNA（RNA3）表示的3'基因组RNA1 387个核苷酸，产生的部分的转录。 RNA3编码，在重叠的读码框，两个小，约11 kDa的非结构蛋白（B1和B2）。这些蛋白质的功能是未知的，既不似乎是必不可少的RNA复制。

nodaviruses，只有4.5 kb的基因组中，很显然，是最简单的，所有的动物病毒。然而，它们的RNA可以在从酵母到哺乳动物细胞中的细胞内环境中的各种各样的大量复制，这意味着所需的宿主细胞因子是保守的。不一定是细胞毒性的，长期的病毒RNA复制的事实，一些nodaviruses可以很容易地建立持续性感染的细胞的培养表示。此外，分段式结构简化了实验操作的nodaviral基因组复制酶基因，表明RNA复制酶功能自然在反供其使用的表达载体中方便的属性。

大多数表达载体使用的DNA模板的转录的RNA在细胞内的积累，一个过程，是线性的DNA模板的拷贝数，取决于实现。nodaviruses和他们的RNA复制酶表达载体的一种新型的发展创造一个有吸引力的机会。本发明的目标是提供最初由宿主细胞产生初级转录，翻译的RNA复制酶的RNA聚合酶转录的DNA质粒。这些初级转录自治区，细胞质，RNA的复制，然后放大。这些载体的性能取决于初级转录的效率比初级转录由nodaviral RNA复制的指数扩增。如上所述，这个过程在一个非常广泛的宿主细胞中大量存在，并且很大程度上独立于细胞代谢活性水平。因此，在这些质粒载体应该是适合用在昆虫，哺乳动物，植物和酵母细胞，静止细胞中的常规的表达载体中，通常情况下失败，他们也可能具有更多的优点。

现有技术的缺陷在放大在细胞中自主RNA复制的可用性的结病毒为基础的表达载体。本发明弥补了这个缺陷。

 

发明内容

本发明提供一种的结病毒为基础的DNA的表达载体，能够得到高水平的重组转录和/或蛋白质的细胞类型在很宽的频谱。该载体包含一个的阿德纳依赖性RNA聚合酶的启动子位点来驱动的初级转录合成。初级转录至少包含两个序列中的元素。初级RNA转录物的5'末端，包含从结病毒的RNA-依赖性RNA聚合酶（RNA复制酶）催化亚基的开放阅读框，优选涌向内部病毒（FHV），Nodamura病毒（NOV）或Pariacoto病毒（PAV）。5'开放读码框的嵌合体在细胞中的初级转录，转染的的结病毒为基础的DNA表达载体，使用宿主细胞的机械翻译产生活跃的结病毒RNA依赖的RNA聚合酶，随后识别和复制的初级转录。此外包括初级RNA转录nodaviral的顺式作用的信号识别所需的RNA复制。的顺式作用的信号侧翼，至少，异源基因，该基因编码一个理想的转录和/或蛋白质（例如，核酶，反义RNA，或蛋白质具有治疗潜力的），例如由异源基因编码的转录扩增RNA复制。优选地，顺式调控元件的位置，编码RNA复制酶的转录也被复制，并随后被放大。此策略产生大量水平的封端的，功能很容易被宿主细胞表达的mRNA在细胞质中。这种新型的表达载体吸引人的特点是它的高表达水平和广泛的宿主范围。