[发明专利]微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术制药领域，具体涉及微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺。

背景技术

Marc-145细胞即恒河猴胚肾上皮细胞，广泛用于猪繁殖与呼吸综合征疫苗的生产。目前，国内各厂家使用的是传统的转瓶培养工艺生产该疫苗。微载体悬浮培养技术将逐步代替传统技术，但是进口微载体的价格较高。从生产成本方面考虑，多次收毒工艺和国产明胶微载体的使用，可提高病毒液收获量和降低生产成本，在实际生产中具有应用前景。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种能够降低猪繁殖与呼吸综合征疫苗生产成本的微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺。

PRRS (即猪繁殖与呼吸综合征，英文：Porcine reproductive and respiratory syndrome，简写：PRRS)。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺，包括以下步骤： 

1）微载体处理：将Cytodex-1型微载体经pH为7.2±0.1的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液浸泡3h，1g微载体需用20—100ml的缓冲液浸泡,所述PBS缓冲液的渗透压在290～320mmol/kg之间，并洗涤2次，将微载体配成2-10g/L的浓度后转移到生物反应器，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，用含体积百分含量10%NBS（即新生牛血清，英文为：New Bovine Serum,简写为：NBS）的DMEM培养液清洗2遍后备用；

或

将GF-240型微载体先用含体积百分含量万分之一吐温的纯净水浸泡溶胀3h，1g微载体需用20—100ml的含吐温的纯净水浸泡，用pH为7.2±0.1的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗2次，所述PBS缓冲液的渗透压在290～320mmol/kg之间。将微载体配成2-10g/L的浓度后转移到生物反应器，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，用含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液清洗2遍后备用。

2）微载体培养Marc-145细胞：利用方瓶、转瓶等细胞培养器皿扩大培养Marc-145细胞，经质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶消化，按每个微载体15—20个细胞的量接种到步骤1）所述的微载体悬液中，补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至最培养终体积的一半后培养。生物反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.2、溶氧30-60%，转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速，在25—50rpm之间。在培养前3h内采用间歇搅拌的方式，所述间歇搅拌是搅拌3-5min,停止25—30min,再搅拌3-5min的反复搅停过程。培养3h后采用固定转速持续搅拌。培养24h时补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至最终体积。

3）细胞培养过程监控和处理：从培养的24h起每12—24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液，以保证生物反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L（因含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液中的葡萄糖含量约4.5g/L），至到每克微载体上细胞总数达到2.5×10⁸个以上。

4）接种病毒：

将步骤3）得到的微载体培养的Marc-145细胞，停止搅拌5-10 min待微载体沉到反应器底部时弃去上清，按M.O.I（即感染复数，英文：multiplicity of infection，简写：M.O.I）为0.01—0.1接种PRRS病毒液，补加细胞培养最终体积一半的维持液培养。生物反应器参数设置：温度37℃、pH7.3±0.1、溶氧30-60%，转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速，在25—50rpm之间。按步骤2）的方法在培养前2h内采用间歇搅拌的方式，培养2h后补加维持液至终体积。所述维持液为含体积百分含量3%NBS的DMEM培养液。

5）收获病毒：

在接毒培养后每隔24h—28h，停止搅拌5-10 min，待微载体沉到反应器底部时收获上清液，收获后加维持液到最培养终体积继续培养再收获上清液，可收获2-3次。

6）国产明胶微载体的使用，可降低生产成本。