[发明专利]一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基

说明书

技术领域

本发明涉及骨髓间充质干细胞的体外成骨细胞诱导分化方法，以及所用的诱导培养基。

背景技术

骨髓间充质干细胞在适当的条件刺激下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞类型，而且易于分离培养，具有较强的自我更新、分化能力和免疫抑制等优点，使其在组织器官缺损性疾病、组织器官退行性疾病以及细胞治疗和组织工程领域具有重要的应用前景。近来有众多的国内外研究探索骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的方法，以期作为骨组织工程的研究基础和临床骨相关疾病生物治疗的理论指导。体外分离纯化的骨髓间充质干细胞经过传代后，相关的生物学特性发生改变，外形未见明显变化，但是已逐渐失去其分化潜能，经过定向诱导分化后只有少量的细胞向所需的方向分化，影响其作为组织工程细胞来源的应用。近来有研究报道将一些与成骨细胞分化相关的细胞因子应用于干细胞成骨分化相关的研究中，对提高骨髓间充质干细胞的成骨分化效率具有一定的生物学效应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法，能提高分化效率。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法，所述方法包括：

（一）骨髓间充质干细胞的体外分离、培养和纯化 

 取骨髓细胞，经筛网过滤后制成单细胞悬液接种于培养皿中进行贴壁培养，初始接种密度为5×10⁶个/mL细胞培养基，培养3小时后更换细胞培养基（组成同前），此后每隔12小时更换一次细胞培养基（组成同前），直到接种后72小时，然后再每隔3天更换细胞培养基（组成同前）继续培养，直到细胞长至80%~90%融合，以胰酶消化，消化时间不超过2分钟，细胞传代后继续培养或直接接种于孔板中用于诱导向成骨细胞分化；所述细胞完全培养基终浓度组成如下：胎牛血清10%（体积百分比浓度），青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基，所述基础培养基为DMEM培养液和F12培养液体积比为1:1的混合物。

（二） 骨贴片培养和培养基上清的获取、保存

采用无菌的显微钳将已经取出骨髓内容物的小鼠股骨和胫骨分成约4mm²大小的骨片，均匀放置于培养皿中，骨髓腔面接触培养皿底，置于37℃、饱和湿度、含5% CO₂的培养箱中进行骨片培养，待培养至72~96小时有大量细胞从骨片爬出时收集其上清液，离心后冻存于－20℃。所述骨片完全培养液终浓度组成如下：胎牛血清10%，青霉素100U/mL，链霉素100mg/L，溶剂为基础培养基，所述基础培养基为DMEM培养液和F12培养液体积比1:1的混合液。

（三） 骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化

原代接种的第1代骨髓间充质干细胞长至80％~90％融合时，添加0.25%胰酶（含有0.02%EDTA）室温消化细胞2分钟，添加完全培养基终止消化后经过离心分离获得细胞沉淀，然后以相同的密度分接种于12孔板中，待细胞扩增至80％融合后添加诱导培养基进行诱导分化。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种用于骨髓间充质干细胞的体外诱导向成骨分化的诱导培养基，所述诱导培养基的终浓度如下：地塞米松1×10^-8 mol/L，抗坏血酸50μmol/L，甘油磷酸钠10 mmol/L，溶剂为所述骨片培养72～96小时的上清液。

优选的，所述诱导培养基终浓度组成如下：地塞米松1×10^-8 mol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，溶剂为所述骨片培养72小时的上清液，所述上清液为骨片完全培养液以及在骨片培养过程中骨细胞分泌的多种细胞因子。

本发明在以往的研究基础上，采用骨片培养上清液和成骨诱导培养基结合的方法，取传代后的第1代骨髓间充质干细胞进行成骨细胞分化，明显提高了骨髓间充质干细胞的成骨分化效率。

本发明的骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法，具有如下优点：

（1）早期诱导可充分体现骨髓间充质干细胞的分化能力。

（2）骨片培养过程中释放到培养液中的多种细胞因子不仅有利于骨髓间充质干细胞的存活，还有利于纯化的骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化。

（3）骨片培养上清液来源方便，获取方法简单可行。

附图说明

图1 为实施例1的成骨细胞分化染色结果图。