[发明专利]海洋芽孢杆菌S-1及其产的抗肿瘤活性多肽

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物及药物领域，特别是涉及一海洋芽孢杆菌S-1（芽孢杆菌S-1）及其产的抗肿瘤活性多肽。 

背景技术

当今社会，恶性肿瘤严重威胁着人类的生命和健康，是人类社会的第一杀手。临床上恶性肿瘤治疗手段多采用综合疗法，以手术切除、放疗、化疗和免疫治疗相结合。目前市场上的治疗癌症相关的药物尽管对大部分癌症有一定疗效，但仍存在着特异性差、疗效不显著和毒副作用明显等问题。因此，寻找高效、低毒、特异性强的抗肿瘤药物仍是生物医学科研领域的重大课题与长期任务。 

微生物界蕴含着极多的天然产物资源，而海洋微生物占到了全部总量的70%，这也成为新药开发的巨大资源。自上世纪60年代起，从海洋寻找天然活性物质成为一大热点。海洋环境有着特殊的生态条件，比如低温、高压、高盐、无光等特殊条件，形成了海洋微生物的复杂性和多样性以及独特的特殊特性等特点，这也使得海洋活性物质的研究充满着活力和潜力,也是当今世界各国从海洋微生物开发新药的中心之一。 

目前，已经从多种海洋微生物的代谢产物中分离出许多具有开发价值的抗肿瘤化合物。尽管如此，海洋微生物抗肿瘤药物的数量仍然是无法与陆生来源的抗肿瘤药物相比。因此，新的抗肿瘤药物的研发仍然需要寻找更多海洋微生物来源的具有生物活性的代谢产物。 

发明内容

本发明的目的在于经发明人长期开发研究海洋微生物和海洋微生物抗肿瘤药物及其生产实践,开发提供一株（种）海洋芽孢杆菌S-1及其产的抗肿瘤活性多肽。 

本发明提供产抗肿瘤活性多肽的海洋芽孢杆菌S-1（芽孢杆菌S-1）是从南海海域的海泥中培养、分离、筛选得到一株（种）产具有抗肿瘤活性多肽（或称海洋芽孢杆菌S-1多肽）的海洋芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的海洋微生物细菌菌株,将其命名为海洋芽孢杆菌S-1（芽孢杆菌菌株S-1（或简称菌株S-1)。对菌株S-1的16S rDNA的基因序列同源性系统发育树分析,PCR产物测序结果显示菌株S-1的16S rDNA的基因序列如图1以及16S rDNA的序列基因长度为1466bp。应用Blast程序进行分析,通过MEGA4.1软件Neighbor-joining绘制发育树如图2，确定菌株S-1为芽孢杆菌属 （Bacillus sp.）的细菌菌株。该海洋芽孢杆菌S-1于2011年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC NO：M2011067。 

本发明提供的海洋芽孢杆菌S-1形态特征与生理生化特征为： 

该菌株S-1为好氧菌,有较好的耐盐性，在7w/v%NaCl培养液中生长良好；生长pH范围为5.0-9.0；生长温度范围较宽，在15℃-37℃环境下也可良好生长;其它形态特征与生理生化特征如表1。 

表1 

注：“+”为反应阳性，“-”为反应阴性。 

本发明提供产具有抗肿瘤活性多肽的海洋芽孢杆菌S-1菌株的鉴定： 

1、菌株的筛选分离 

1）菌株的分离 

从南海海域的海泥中培养、筛选、分离得到的单个细菌菌株（或简称菌株），-80℃冰箱甘油保种。随机吸取出100μL甘油保种的菌株，接种于30ml的种子（活化）培养基，于30℃、200r/min的摇床里恒温培养24h，所述种子培养基:10g/L蛋白胨,3g/L葡萄糖,5g/L NaCl，pH=7.0，121℃灭菌30min。 

2)菌株的发酵培养 

将种子发酵液按照4v/v%接种量接种于300mL发酵培养基中，相同条件下继续培养36h，得菌株（种）发酵液。所述发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，3g/L葡萄糖,氯化钠5g/L，1mol/L NaOH调pH值为7.0，121℃灭菌30min。 

3）代谢产物的制备 

取菌株发酵液，在10000r/min离心20min，去除发酵液中的菌体和杂质。上清液加入与发酵液等体积的水饱和正丁醇萃取发酵液，每次萃取6h，收集上层有机相。 然后用旋转蒸发仪在80℃减压蒸干。减压蒸干的样品经重溶、离心、冻干后，得到具有抗肿瘤活性的粗提物。 

4）MTT法检测代谢产物抗肿瘤活性