[发明专利]多氧霉素Polyoxin B组分高产菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多氧霉素B组分高产菌株及其构建方法，属于生物制药领域。

背景技术

多氧霉素(Polyoxin，POL)是重要的肽基核苷类抗生素，由于其对农作物、果蔬及一些经济植物真菌病害有良好防治作用，加之对环境友好，故自创制成功便在农业上大规模推广使用，迄今为止，多氧霉素仍是世界上投产与使用最广泛且未产生耐药性的农用抗生素之一。

多氧霉素属于多组分抗生素，在所有的组分中，polyoxin A与polyoxin H为主要组分，polyoxin B，polyoxin D，polyoxin K以及polyoxin L是少量组分，但是生物活性最高的组分却是后四者。因此提高polyoxin B、polyoxin D、polyoxin K或polyoxin L的含量，是提高多氧霉素抗菌能力的重要手段。

在传统育种实践中，通过诱变筛选的方式来提高多氧霉素的效价，但是这种方式，不确定因素多，筛选工作大，育种缓慢，并且往往是整体对多氧霉素产生影响，生物活性较弱的组分效价也相应提高，难以有效提高特定活性组分的含量。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对上述不足提供一种能够定向积累多氧霉素Polyoxin B组分的高产菌株；

本发明的第二个目的在于提供构建上述高产菌株的方法；

本发明的第三个目的在于提供用于构建上述高产菌株的专用载体。

本发明前期研究已成功克隆S. aureochromogenes工业菌株中多氧霉素生物合成基因簇。Polyoxin A与B组分的区别在于前者含有POIA基团，而本发明发现的基因簇中polF参与POIA基团的生物合成，本发明选择polF基因进行定向突变，结果获得了Polyoxin B组分的高产菌株，命名为CXR3。

据此，本发明提供一种定向积累多氧霉素Polyoxin B组分的基因工程菌，该菌的polF基因发生突变，丧失功能。由于polF处于polC-polQ2转录单元中，同框缺失可避免潜在的极性效应，因此优选所述突变为同框缺失突变。所述基因工程菌的出发菌可以使产多氧霉素的任何菌株，包括但不限于金色产色链霉素（S. aureochromogenes）。

本发明还提供上述多氧霉素Polyoxin B组基因工程菌的构建方法，该方法通过构建polF基因敲除载体，将该载体导入到目标菌株后筛选阳性菌株。所述基因敲除载体带有报告基因。优选所述基因敲除不改变polF基因的阅读框。

具体地，该基因工程菌的构建方法包括如下步骤：

1)以polFlaF和polFlar(其序列如SEQ ID No.1&2所示)为引物，扩增2.5-kb的片断，经BglII切后，克隆到pOJ446的BglII和HpaI位点之间，构建成pJTU4721；再以引物polFraF和polFraR(其序列如SEQ ID No.3&4所示)扩增的2.5-kb的片断克隆到pJTU4721的XbaI和BglII位点之间，构建成polF的同框缺失载体pJTU4722；

2) 将来自pJTU2180+的tsr基因插入载体pJTU4722的BglII位点，构建成polF的中断载体pJTU4723；

3)将质粒pJTU4723通过导入多氧霉素工业菌株中，筛选得到tsr插入polF的插入突变株；

4)将polF的tsr插入突变株中tsr置换出来，并筛选阳性菌株。

实验表明，本发明基因工程菌用于多氧霉素的生产能够有效提高多氧霉素中的Polyoxin B组分，从而提高多氧霉素的活性。

本发明还提供一种制备多氧霉素的方法，该方法是通过培养上述述的基因工程菌，并从发酵液中分离得到多氧霉素。

本发明还提供一种用于制备上述基因工程菌的载体，该载体包括polF基因上下游各2.5kb的基因片段和来自pJTU2180+的tsr基因。本发明通过基因工程手段，对产多氧霉素的工程菌进行改造，将其polF基因进行突变，得到了定向积累多氧霉素Polyoxin B组分的高产菌株CXR3，提高了多氧霉素组分中Polyoxin B的产量，提高了多氧霉素的相对生物效价。

 

附图说明